Template:KIT-Kyoto-Augsut23

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Revision as of 11:11, 3 October 2010

August 23

>>top

Time

9:00~21:00

Member

岩城,竹内,中村,臼井,吉村
Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Yoshimura

Title

(1) 大腸菌の生存曲線を調べる [吉村] 
(2) dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック [中村、臼井]
(3) dps,acrABのDNA濃度測定 [中村、臼井]

Purpose

(1) 大腸菌の生存曲線を調べる
(2) 活性酸素応答のプロモーターをPCRで増やし、ちゃんと増えたかを泳動でチェック
(3) dps,acrABのDNA濃度を測定し、PCRして増やすのに十分な濃度であるかを確認する。

Method

(1) 大腸菌の生存曲線を調べる
 30% H2O2(500μl)とミリQ(600μl)で4MのH2O2をつくった
 ↓4M H2O2(250μl)とミリQ(750μl)で1MのH2O2をつくった
 ↓以下10倍希釈していき、1nM H2O2まで作成した
 次にDH5αのシングルコロニーをピックアップした
 ↓LB(-amp)2mlでプレカルチャーを行った
 ↓(37℃でインキュベート、overnight)
(2) dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック
 dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCRを以下の組成、設定で行った
<組成>
(dps,grxA,trxC)(oxyR)
PrimerR1.5μLPrimerR3μL
PrimerF1.5μLPrimerF3μL
dNTP5μLdNTP20μL
Buffer5μLBuffer(KOD-FX)50μL
DNA(DH5α)0.5μLDNA(DH5α)2μL
MgSO44μLMilliQ20μL
MilliQ31.5μLKOD-FX2μL
KOD-Plus1μL
全量50μL全量100μL
<PCRの設定>
(dps,grxA ,trxC)(oxyR)
1.Pre Penature94℃―2min94℃―2min
2.Denature94℃―15sec94℃―10sec
3.Annealing59.7℃―30sec52℃―30sec
4.Extension68℃―30sec68℃―45sec
5.+Extension68℃ー2min68℃ー2min


またPCR後、それぞれ電気泳動によるチェックを以下の条件で行った
 1回目 100V、20min EtBr 20min
 2回目 135V、15min EtBr 10min

(3) dps,acrABのDNA濃度測定
 吸光計により、dpsとacrABのOD260を5回測定し、その平均をとった

Results

(1) 実験結果は25日のノートに記載した
(2) 1回目の電気泳動で、grxA、trxC のバンドがほとんど確認されなかった
2回目を行ったところ、1回目よりはバンドがよく見えたが、十分に増えたとは言えなかった
*詳細は写真参照
(3) 吸光度の測定結果
以下の吸光度の結果から、PCRが十分と判断された
吸光度dpsacrAB
1回目0.3400.565
2回目0.3290.555
3回目0.3140.556
4回目0.3090.556
5回目0.3120.551
平均値0.3210.557