Template:KIT-Kyoto-Augsut23
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+ | :: 吸光計により、dpsとacrABのOD260を5回測定し、その平均をとった。 | ||
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- | + | :(1) 実験結果は25日のノートに記載した。 | |
- | 吸光度 dps | + | :(2) 1回目の電気泳動で、grxA、trxC のバンドがほとんど確認されなかった。 |
- | 1回目 0.340 | + | ::2回目を行ったところ、1回目よりはバンドがよく見えたが、十分に増えたとは言えなかった。 |
- | 2回目 | + | ::*詳細は写真参照 |
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Revision as of 08:49, 11 September 2010
August 23
【時間】
- 9:00~21:00
【実験担当】
- 岩城,竹内,中村,臼井,吉村
【実験名】
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる
- (2) dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック
- (3) dps,acrABのDNA濃度測定
【実験目的】
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる(1日目)
- (2) 活性酸素応答のプロモーターをPCRで増やし、ちゃんと増えたかを泳動でチェック
- (3) dps,acrABのDNA濃度を測定し、PCRして増やすのに十分な濃度であるかを確認する。
【実験内容】
- (1) 大腸菌の生存曲線を調べる
- 30% H2O2(500μl)とミリQ(600μl)で4MのH2O2をつくった
- ↓4M H2O2(250μl)とミリQ(750μl)で1MのH2O2をつくった
- ↓以下10倍希釈していき、1nM H2O2まで作成した
- 次にDH5αのシングルコロニーをピックアップした
- ↓LB(-amp)2mlでプレカルチャーを行った
- ↓(37℃でインキュベート、overnight)
- (2) dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCR+電気泳動によるチェック
- dps,grxA,trxCおよびoxyRのPCRを以下の組成、設定で行った
<組成> (dps,grxA,trxC) (oxyR) PrimerR 1.5μL PrimerR 3μL PrimerF 1.5μL PrimerF 3μL dNTP 5μL dNTP 20μL Buffer 5μL Buffer(KOD-FX) 50μL DNA(DH5α) 0.5μL DNA(DH5α) 2μL MgSO4 4μL MilliQ 20μL MilliQ 31.5μL KOD-FX 2μL KOD-Plus 1μL 全量 50μL 全量 100μL <PCRの設定> (dps,grxA ,trxC) (oxyR) 1.Pre Penature 94℃―2min 94℃―2min 2.Denature 94℃―15sec 94℃―10sec 3.Annealing 59.7℃―30sec 52℃―30sec 4.Extension 68℃―30sec 68℃―45sec 5.+Extension 68℃ー2min 68℃ー2min
- またPCR後、それぞれ電気泳動によるチェックを以下の条件で行った。
- 1回目 100V、20min EtBr 20min
- 2回目 135V、15min EtBr 10min
- (3) dps,acrABのDNA濃度測定
- 吸光計により、dpsとacrABのOD260を5回測定し、その平均をとった。
【実験結果】
- (1) 実験結果は25日のノートに記載した。
- (2) 1回目の電気泳動で、grxA、trxC のバンドがほとんど確認されなかった。
- 2回目を行ったところ、1回目よりはバンドがよく見えたが、十分に増えたとは言えなかった。
- *詳細は写真参照
- (3) 吸光度の測定結果
- 以下の吸光度の結果から、PCRに十分と判断された。
吸光度 dps acrAB 1回目 0.340 0.565 2回目 0.329 0.555 3回目 0.314 0.556 4回目 0.309 0.556 5回目 0.312 0.551 平均値 0.321 0.557