Template:KIT-Kyoto-Augsut21

From 2010.igem.org

(Difference between revisions)
(August 21)
(August 21)
Line 101: Line 101:
::<TD>2min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>20sec</TD><TD>保持</TD></TR>
::<TD>2min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>20sec</TD><TD>保持</TD></TR>
::<TR>
::<TR>
-
::<TD></TD><TD COLSPAN="3">35サイクル</TD><TD></TD><TD></TD></TR>
+
::<TD></TD><TD COLSPAN="3">35サイクル</TD><TD></TD></TR>
::</TABLE>
::</TABLE>
::</TD></TR></TABLE>
::</TD></TR></TABLE>

Revision as of 11:08, 3 October 2010

August 21

>>top

Time

9:00~

Member

竹内、革島、足立、吉村
Takeuchi,Kawashima,Adachi,Yoshimura

Title

(1) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動 [革島 ]
(2) pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ [足立,吉村]
(3) AcrAB,PoxyのPCR [竹内]

Purpose

(1) DH5αにプラスミド(pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450))が挿入されているかのチェック
(2) DH5α(R0040),DH5α(I13522)のプラスミド抽出
(3) AcrAB,PoxyのPCR

Method

(1) pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動
 8月20日(金)にアルカリミニプレップによって取り出したプラスミド、
 DNA(pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450))の確認を電気泳動によって行った
 pSB6A1(K121013)(左から2~5番目のコーム),
 pSB6A1(J04450)(左から6~8番目のコーム)を5μLずつ、
 それぞれLoading Buffer 1μLを加え6倍希釈にしコームに流した
 ↓1kbp radder(1番左のコーム)をマーカーとして使用し、100vで25分間電気泳動を行った
 ↓EtBr染色(10mg/ml)・・・・・10min
 ↓泳動結果を写真撮影した
(2) pSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ
 8月20日(金)に培養したpSB1A2(R0040),pSB1A2(I13522)1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した
 ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
 ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
 ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
 ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)
 ↓5分間、氷上で放置した
 ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)
 ↓5分間、氷上で放置した
 ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
 ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
 ↓等量(400μL)のイソプロピルアルコールを加えた
 ↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した
 ↓70%EtOHを1mL加えた(vortex)
 ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心
 ↓30秒間、遠心乾燥を行った
 ↓RNA in TE 30μLを加えてプラスミドDNAとした
 制限酵素処理と電気泳動
右の表に従い試薬を調整し、これを37℃で1時間インキュベートした
↓Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した
 (マーカーは1kbp radderを使用した)
↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した
↓泳動結果を写真で撮影した
<試薬組成>
EcoR1μL
Pst1μL
プラスミドDNA
(DH5α(R0040),DH5α(I13522))
5μL
H2O11μL
H Buffer2μL
20μL
(3) AcrAB,PoxyのPCR
 以下の試薬組成、プログラムに従ってPCRを行った
試薬組成
(1)(2)(3)
テンプレートDNA(DH5α)1μL1μL2μL
MgSO42μL4μL3μL
primer F1.5μL1.5μL1.5μL
primer R1.5μL1.5μL1.5μL
KOD-Plusー1μL1μL1μL
H2O33μL31μL32μL
dNTPs5μL5μL5μL
total50μL50μL50μL
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention
94℃94℃62.8℃68℃4℃
2min15sec30sec20sec保持
35サイクル
 結果は写真参照

Results

(1) 写真の結果
pSB6A1(K121013)のバンドは4つとも見えなかった
   →アルカリミニプレップのやり直し
pSB6A1(J04450)の3つのバンドは、3つともバンドが見えた(ただし一番左のみ少し)
pSB6A1(J04450)に関しては十分量DH5αにベクターが組み込まれたとみなし実験でこれを使用した
(2) DH5α(R0040),DH5α(I13522)それぞれ3種類ずつアプライしたのだが、
全てバンドがはっきりと見えたため、プラスミド挿入が成功していることが確認された
(3) 十分なバンドを確認することができなかった。

Consideration

(1) pSB6A1(K121013) → アルカリミニプレップのやり直し
(3) テンプレートDNAはもっと少なくするべき
 MgSO4は4 μlでやるべき
 プライマーが間違っている可能性もあり