Team:KIT-Kyoto-こっそり

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:　EcoRⅠ,PstⅠ・・・・1μL<br>
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:　プラスミドDNA・・・5μL<br>
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:(マーカーは1kbp radderを使用した)<br>
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:100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色<br>
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:泳動結果を写真で撮影した<br>
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:(3)AcrAB,oxyRのPCR試薬組成<br>
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テンプレートDNA(DH5α) 1μL 1μL  2μL 
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  MgSO4 2μL 1.5μL  1.5μL 
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プライマーF 1.5μL 1.5μL  1.5μL 
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プライマーＲ 1.5μL 1.5μL  1.5μL 
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KOD -Plusｰ 1μL 1μL  1μL 
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  H2O 33μL 31μL  32μL 
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dNTPs 5μL 5μL  5μL 
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  total 50μL 50μL 50μL''' <br>
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:(設定)<br>
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:Pre　Denature・・・94℃、2min<br>
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:・Denature・・・・・・・94℃、15sec<br>
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:・Annealing・・・・・・62.8℃、30sec<br>
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:・Extension・・・・・・68℃、20sec<br>
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:　　　　　　　　　　　　4℃、∞<br>
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:結果は写真参照<br>

Revision as of 06:08, 8 September 2010


てすてす。
ようこそ実験場へ。

まずはwikiに慣れるところから始めよう、うん。

改行は有効かどうか。


8月17日(火)
2010/08/24 16:39 に 吉村礼桜 が投稿

【時間】　9:00～17:00

【実験担当】岩城,福山,古道,革島,吉村

【実験目的】

(1)pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のカットチェック
(2)pSB3K3,pSB6Aのミディプレップ
(3)コンピテントセルの調整


【実験内容】

(1)pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のシングルコロニーをピックアップし、それぞれ
　　pSB1A2(12-M)→LB(+amp)(2ml)
　　pSB1C3(3-A)→LB(+クロラムフェニコール)(2ml)
　　に入れ、6時間ほど振とう培養。
　　↓
　　それぞれをアルカリミニプレップ
　　↓
　　制限酵素処理
　　・ミリQ　11μl
　　・Hバッファー　2μl
　　・DNA(pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A))　5μl
　　・制限酵素(EcoRⅠ,PstⅠ)　各1μl
　　↓
　　1時間37℃でインキュベート
　　↓
　 電気泳動





【実験結果】

(1)バンドがはっきり見えたので、これらを大量培養する。




無駄に長いページを作成しております。。。



8月21日(土)
2010/08/27 17:27 に 臼井一馬 が投稿 [ 2010/08/28 18:18 に更新しました ]
【時間】　9:00～

【実験担当】竹内、革島、足立、吉村

【実験名】

(1)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動
(2)DH５α(R0040),DH５α(I13522)のアルカリミニプレップ
(3)AcrAB,PoxyのPCR




【実験目的】

(1)DH５αにプラスミド(pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450))が挿入されているかのチェック
(2)DH５α(R0040),DH５α(I13522)のプラスミド抽出
(3)AcrAB,PoxyのPCR


【実験内容】

(1)
８月２０日(金)にアルカリミニプレップによってプラスミドDNA(pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450))を取り出したものの確認を電気泳動によって行った。


＜手順＞

(1)
pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450)5μLずつにそれぞれLoading Buffer 1μLを加え六倍希釈にしコームに流した。
　　　　　　↓
1kbp radderをマーカーとして使用し電気泳動を行った(100V,25min)
　　　　　　↓
EtBr染色(10mg/ml)・・・・・10min
　　　　　　↓
泳動結果を写真撮影した。


(2)
8月20日(金)に培養したDH５α(R0040),DH５α(I13522)1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した
　　　　　　↓
4℃、14,000rpm、5min遠心した
　　　　　　↓
上澄みをデカンテーションで取り除いた
　　　　　　↓
菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
　　　　　　↓
SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)・・・5min on ice
　　　　　　↓
SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)・・・・・5min on ice
　　　　　　↓
4℃、14,000rpm、10min遠心した
　　　　　　↓
上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
　　　　　　↓
等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
　　　　　　↓
4℃、14,000rpm、20min遠心した
　　　　　　↓
70％EtOHを1mL加えた(vortex)
　　　　　　↓
4℃、14,000rpm、10min遠心した
　　　　　　↓
30sec　遠心乾燥した
　　　　　　↓
RNA in TE 30μLを加えてプラスミドDNAにした


カットチェック(電気泳動)


＜組成＞

　EcoRⅠ,PstⅠ・・・・1μL
　プラスミドDNA・・・5μL
　(DH５α(R0040),DH５α(I13522))
　H2O・・・・・・・・11μL
　H Buffer・・・・・・2μL
計20μL


→　1h,37℃でインキュベート


Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した
(マーカーは1kbp radderを使用した)
　　　　　　　　↓
100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
　　　　　　　　↓
泳動結果を写真で撮影した



(3)AcrAB,oxyRのPCR試薬組成


　　　(1) 　　　(2) 　　　(3) 

テンプレートDNA(DH5α) 1μL 1μL  2μL  
 MgSO4 2μL 1.5μL  1.5μL

プライマーF 1.5μL 1.5μL 1.5μL 

プライマーＲ 1.5μL 1.5μL  1.5μL  
KOD -Plusｰ 1μL 1μL  1μL  
 H2O 33μL 31μL  32μL

dNTPs 5μL 5μL 5μL 

 total 50μL 50μL 50μL



(設定)
Pre　Denature・・・94℃、2min
35Cycles↓
・Denature・・・・・・・94℃、15sec
・Annealing・・・・・・62.8℃、30sec
・Extension・・・・・・68℃、20sec
　　　　　　　　　　　　4℃、∞
結果は写真参照
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