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From 2010.igem.org

てすてす。
ようこそ実験場へ。

まずはwikiに慣れるところから始めよう、うん。

改行は有効かどうか。


8月17日(火)
2010/08/24 16:39 に 吉村礼桜 が投稿

【時間】　9:00～17:00

【実験担当】岩城,福山,古道,革島,吉村

【実験目的】

(1)pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のカットチェック

(2)pSB3K3,pSB6Aのミディプレップ

(3)コンピテントセルの調整

【実験内容】

(1)pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のシングルコロニーをピックアップし、それぞれ

　　pSB1A2(12-M)→LB(+amp)(2ml)

　　pSB1C3(3-A)→LB(+クロラムフェニコール)(2ml)

　　に入れ、6時間ほど振とう培養。

　　↓

　　それぞれをアルカリミニプレップ

　　↓

　　制限酵素処理

　　・ミリQ　11μl

　　・Hバッファー　2μl

　　・DNA(pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A))　5μl

　　・制限酵素(EcoRⅠ,PstⅠ)　各1μl

　　↓

　　1時間37℃でインキュベート

　　↓

　 電気泳動

【実験結果】

(1)バンドがはっきり見えたので、これらを大量培養する。

無駄に長いページを作成しております。。。



8月21日(土)
2010/08/27 17:27 に 臼井一馬 が投稿 [ 2010/08/28 18:18 に更新しました ]
【時間】　9:00～

【実験担当】竹内、革島、足立、吉村

【実験名】

(1)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)の電気泳動

(2)DH５α(R0040),DH５α(I13522)のアルカリミニプレップ

(3)AcrAB,PoxyのPCR

【実験目的】

(1)DH５αにプラスミド(pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450))が挿入されているかのチェック

(2)DH５α(R0040),DH５α(I13522)のプラスミド抽出

(3)AcrAB,PoxyのPCR

【実験内容】

(1)

８月２０日(金)にアルカリミニプレップによってプラスミドDNA(pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450))を取り出したものの確認を電気泳動によって行った。

＜手順＞

(1)

pSB6A1(K121013),pSB6A1(J04450)5μLずつにそれぞれLoading Buffer 1μLを加え六倍希釈にしコームに流した。

　　　　　　↓

1kbp radderをマーカーとして使用し電気泳動を行った(100V,25min)

　　　　　　↓

EtBr染色(10mg/ml)・・・・・10min

　　　　　　↓

泳動結果を写真撮影した。

(2)

8月20日(金)に培養したDH５α(R0040),DH５α(I13522)1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した

　　　　　　↓

4℃、14,000rpm、5min遠心した

　　　　　　↓

上澄みをデカンテーションで取り除いた

　　　　　　↓

菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)

　　　　　　↓

SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)・・・5min on ice

　　　　　　↓

SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)・・・・・5min on ice

　　　　　　↓

4℃、14,000rpm、10min遠心した

　　　　　　↓

上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　　　　　　↓

等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　　　　　　↓

4℃、14,000rpm、20min遠心した

　　　　　　↓

70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　　　　　　↓

4℃、14,000rpm、10min遠心した

　　　　　　↓

30sec　遠心乾燥した

　　　　　　↓

RNA in TE 30μLを加えてプラスミドDNAにした

カットチェック(電気泳動)

＜組成＞

　EcoRⅠ,PstⅠ・・・・1μL

　プラスミドDNA・・・5μL

　(DH５α(R0040),DH５α(I13522))

　H2O・・・・・・・・11μL

　H Buffer・・・・・・2μL

計20μL

　　　　→　1h,37℃でインキュベート

Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した

(マーカーは1kbp radderを使用した)

　　　　　　　　↓

100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色

　　　　　　　　↓

泳動結果を写真で撮影した

(3)

AcrAB,oxyRのPCR試薬組成

	(1)	(2)	(3)
テンプレートDNA(DH5α)	1μL	1μL	2μL
MgSO4	2μL	1.5μL	1.5μL
プライマーF	1.5μL	1.5μL	1.5μL
プライマーR	1.5μL	1.5μL	1.5μL
KOD -Plus-	1μL	1μL	1μL
H2O	33μL	31μL	32μL
dNTPs	5μL	5μL	5μL
total	50μL	50μL	50μL

(設定)

Pre　Denature・・・94℃、2min

35Cycles↓

・Denature・・・・・・・94℃、15sec

・Annealing・・・・・・62.8℃、30sec

・Extension・・・・・・68℃、20sec

　　　　　　　　　　　　4℃、∞

結果は写真参照