Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September24
From 2010.igem.org
- Miniprep of Arac+RBS+pSB1A3
- Follow quality check
Miniprep of Arac+RBS+pSB1A3
- Transfered E.coli solution to 1.5 mL tubes, 1 mL each
- Centrifuged at 4C, 15000rpm for 1min
- Discarded the supernatant
- Suspended on 125 uL of Buffer P1 each
- Added 175 uL Buffer N3 each mixed by inversion
- Centrifuged at 4C, 13000rpm for 10min
- Transfered the supernatant to filtration column
- Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
- Discarded the flow-through
- added 500 uL of Buffer PB to filtration column
- Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
- Discarded the flow-through centrifuged for 1min to remove remaining buffer
- Transfered filtration column to a new 1.5 ml tube
- Resuspended on 50 ul of TE and incubated at RT for 1min
- Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
miniprep後のサンプル泳動
1 uLのサンプルとloading buffer1 uL混ぜ、6 uLのλ/Hind Ⅲ EcoRⅠとともに泳動した。
マーカーとの比較からこのプラスミドは7000bp位の大きさだと思われる。
Arabinose Promoter+RBS+pSB1A3のbp数が3455bpなので、パーツ及びベクターを2個ずつ含むプラスミドであると考えられる。
この写真から、プラスミド溶液の濃度は30 ng/uL と推定した。
plasmidとGFP+double terminatorのdigestion
以下の組成で試薬を調整した。
Reagent | Amount |
---|---|
DW | 5.6 uL |
10x H Buffer | 1 uL |
0.1% BSA | 1 uL |
Spe I | 0.2 uL |
Pst I | 0.2 uL |
plasmid | 2 uL |
Total | 10 uL |
Reagent | Amount |
---|---|
DW | 34 uL |
10x M Buffer | 5 uL |
0.1% BSA | 5 uL |
Xba I | 4 uL |
Pst I | 0.4 uL |
GFP+double terminator | 1.6 uL |
Total | 50 uL |
- 37C,1hour置いた。
- Mycrocon YM-10を使って切れ端の除去を行う。sampleが500 uLになるようにTEを加え、カラムに移した。
- 4C,14000g,1hour遠心した。
- 上澄みが30 uL前後残ったので、それを新しいcollection tubeに移し、カラムを逆さまにして挿入した。
- 4C,1000g,3min遠心した。
- GFP+double terminatorが30 uL、plasmid25 uL回収できたので、各1/10量の3M CH3COONaを加えた。
- 100%EtOHを回収量の2.5倍量加え、voltexにかけた。
- 4C,15000rpm,10min遠心した。
- 上澄みを捨て、70%EtOHを500 uL加え、voltexにかけた。
- 4C,15000rpm,5min遠心した。
- 上澄みを捨て、真空装置へ入れよく乾燥させた。
- 2 uLのTEで溶かした。
- -20Cで凍結保存した。
Transformation of BAC Vector
- Used DH5Alpha and MG1655 strains for electroporation
- Plated at 19:15
- Will be incubated for 18 h