Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September23

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*Bac Vector の精製
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*Amplifiable BAC plasmid([http://partsregistry.org/Part:BBa_J61031 BBa_J61031]) Purification
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*AraC+RBS+pSB1A3のコロニーPCR
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*Colony PCR of AraC+RBS+pSB1A3
*DH5αとMG1655へのBac Vecterのelectroporetion
*DH5αとMG1655へのBac Vecterのelectroporetion

Revision as of 11:58, 21 October 2010

  • Amplifiable BAC plasmid([http://partsregistry.org/Part:BBa_J61031 BBa_J61031]) Purification
  • Colony PCR of AraC+RBS+pSB1A3
  • DH5αとMG1655へのBac Vecterのelectroporetion

Bac Vecter Purification

miniprepはQiagenのminiprep kit,qiaprepを用いて行った。

1)昨日から培養してあったBac Vector保有株を1.3ml,1.5mlエッペンチューブに移した。

2)4C、15000rpmで1min遠心を行った。細胞塊が沈殿した。

3)上澄みを捨て、残りのサンプルをチューブに移した。

4)4C、15000rpmで1min遠心を行った。細胞塊が沈殿した。

5)上澄みを捨て、4℃で保存していたBuffer P1を250 ul加え、voltexにかけた。細胞塊は見えなくなった。

6)Buffer P2を250 ul加え、静かに数回転倒混和した。溶液の色が緑色に変化した。

7)Buffer N3を350 ul加え、すぐに数回転倒混和した。溶液が白濁した。

8)4C,13000rpmで10min遠心した。

9)上澄みをピペットマンで専用のカラムに移し、4C,13000rpm,1min遠心した。

10)下澄み液を捨て、500 ulのBuffer PBを加えて4C,13000rpm,1minで遠心を行った。

11)下澄み液を捨て、さらに1min遠心した。

12)新しい1.5 ml チューブにカラムを移し、TEを50 ul加えて1min放置した。

13)4C,13000rpm,1min遠心を行った。

14)-20Cで凍結保存した。


AraC+RBS+pSB1A3のコロニーPCR

  1. コロニーを無作為に16個選び、番号を振った。
  2. 0.5 mLチューブを16本用意し、それぞれにDWを10 uLずつ分注した。
  3. チューブに番号を振り、対応するコロニーを懸濁した。
  4. コロニーPCR溶液を以下の組成に従って調整した。
Reagent Amount
Taq Master Mix 90 uL
Ex-F 1.8 uL
Ps-R 1.8 uL
Total 93.6 uL