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Template:KIT-Kyoto-Augsut28
From 2010.igem.org
August 28
Time
- 9:00～
Member
- 岩城,竹内,中村,臼井,革島
- Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Kawashima
Purpose
- Making of primer mix of AcrAB,dps,SodA and OxyR.[Takeuchi,Usui]
- PCR of AcrAB and OxyR.[Iwaki]
- PCR of dps and hemH.[Usui]
- Agarose gel electrophoresis of dps and hemH.[Iwaki]
- DNA miniprep of pSB1A2(E0420) and pSB1A2(I13522).[Nakamura]
- Agarose gel electrophoresis of pSB1A2(E0420) and pSB1A2(I13522).[Nakamura]
- (1) AcrAB,dps,SodA,OxyRのプライマーミックス(PM)の作成 [竹内、臼井]
- (2) AcrAB,oxyRのPCR [岩城]
- (3) dps,hemHのPCR [臼井]
- (4) dps,hemHの電気泳動 [岩城]
- (5) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ [中村]
- (6) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)の電気泳動 [中村]
Method
- (1) Primer MIXの作成
- AcrAB,dps,SodA,OxyRのPrimerF,PrimerRそれぞれ10μLずつを80μLのH2Oに溶解し、
- 全量100μL、10pmol/μLにした溶液(PrimerMIX)を作成した
- (2) AcrAB,oxyRのPCR
＜PCR試薬組成＞ AcrAB oxyR PrimerF 1.5μL 1.5μL dNTPs 5μL 5μL KOD-Plus- Buffer 5μL 5μL テンプレートDNA(DH5α) 1μL 1μL MgSO4 4μL 4μL H2O 33μL 33μL KOD-Plus- 1μL 1μL total 50μL 50μL ＜設定＞ Pre Denature 94℃ 2min 35Cycles↓ Denature 94℃ 15sec Annealing 62.8℃ 30sec Extension 68℃ 30sec +Extension 68℃ 2min 4℃ ∞
- (3) dps,hemHのPCR
＜PCR試薬組成＞ dps hemH PrimerF 1.5μL 1.5μL dNTPs 5μL 5μL KOD-Plus- Buffer 5μL 5μL テンプレートDNA(DH5α) 0.5μL 0.5μL MgSO4 4μL 4μL H2O 33μL 33μL KOD-Plus- 1μL 1μL total 50μL 50μL ＜設定＞ Pre Denature 94℃ 2min 35Cycles↓ Denature 94.0℃ 15sec Annealing 60.0℃ 30sec Extension 68.0℃ 30sec +Extension 68.0℃ 2min 4℃ ∞
- (4) dps,hemHの電気泳動
- (3)のPCRの後、増幅を確認するために電気泳動にかけ、写真撮影を行った
- 諸条件を以下に示す
- ＜条件＞
- DNA量 5μL
- 電気泳動 100V 30min
- EtBr処理 20min
- (5) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ
- pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)について同様の操作を行った
- 培養後の培養液1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した
- ↓4℃、14,000rpm、5min遠心
- ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
- ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)
- ↓SolutionⅡ200μLを加え混合
- ↓5min on ice
- ↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
- ↓5min on ice
- ↓4℃、14,000rpm、10min遠心
- ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
- ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
- ↓4℃、14,000rpm、20min遠心
- ↓70％EtOHを200μL加える
- ↓4℃、14,000rpm、10min遠心
- ↓30sec 遠心乾燥
- ↓TE30μL加えてプラスミドDNAとした
- (6) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)の電気泳動
- pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ後、電気泳動を行いチェックした
- ＜条件＞
- DNA量 5μL
- 電気泳動 100V 20min
- EtBr処理 20min
Results
- (1) 今回作成したPMは今後使用していく予定
- (2) 後日電気泳動により増幅の確認を行う
- (3,4) hemH、dpsに関してははっきりとバンドが見え、増幅が確認された
- (5,6) pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)共に明瞭なバンドが確認された
- ＊詳細は写真参照
Remarks
- (3,4)SpeⅠが届き次第、制限酵素処理を行う
- (5,6)pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のプレートからシングルコロニーをピックアップして、LB培地(1)で培養
