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From 2010.igem.org

Contents 1 September 5 2 September 6 3 September 7 4 September 8 5 September 9 6 September 10 7 September 11

September 5

Time

9：30～

Member

岩城、竹内、吉村

Iwaki,Takeuchi,Yoshimura

Purpose

(1)　前日にシングルコロニーピックアップをしたpSB1C3(J04450)を

制限酵素処理を行うことにより、目的プラスミドの挿入を確認した

(2)　プロモーター挿入用のpSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507)

インサートを切り出してI13507の挿入用のpSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出

(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション

Method

(1)　pSB1C3のプラスミド抽出と制限酵素処理による確認

　前日に2つのシングルコロニーをピックアップし2 mlのLB培地(+Cam)で37℃で一晩培養した

　↓1.5 mlをチューブに採った

　↓25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓カラムを新しいチューブに乗せ換えた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　それぞれ10 µlを別のチューブに採った

　↓H bufferを5 µl加えた

　↓蒸留水を34 µl加えた

　↓EcoRⅠとPstⅠを0.5 µlずつ加えた

　↓37℃で1.5時間インキュベートした

　↓1 %ゲルを用いて、100 Vで25分間電気泳動した

　↓20分間EtBrで染色した

　↓紫外線を照射し写真を撮影した

(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出

PCR用のpSB6A1,RFP,pSB6A1を右表1,2の組成で平常通り制限酵素処理した 　↓右表3,4の組成でゲルにアプライした 　↓50Vで30分間電気泳動した 　↓UVを照射してゲルを切り出した 　↓H2O　400μLを加えた 　↓65℃　40minでヒートブロック 　↓Phe等量加えて　vortex 　↓cfg.　14500rpm　5min　25℃ 　↓上清を新チューブへ 　↓Phe/Chl等量　voltex　　 　↓cfg. 14500rpm　5min　25℃ 　↓上清を新チューブへ 　↓3M CH3COONa　50μLを加えた 　↓イソプロ　800μLを加えた 　↓cfg.　14500rpm　10min　4℃ 　↓上清除き、70％EtOH 150μL 　↓cfg.　14500rpm 5min 4℃ 　↓遠心乾燥機　5min 　↓MilliQ　10μLを加えた			表1: PCR用pSB6A1 DNAsol 262μL EcoRⅠ 4μL XbaⅠ 4μL Buffer M 30μL total 300μL			表2: RFP,pSB6A1 DNAsol 85μL EcoRⅠ 2.5μL PstⅠ 2.5μL Buffer H 10μL total 100μL
			表3: PCR用のpSB6A1 DNA 300μl Orange Loading Dye 50μl			表4: RFP,pSB6A1 DNA 100μl Orange Loading Dye 20μl

(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション

　コンピテントセルにDNAを入れた

　↓20分間氷冷した

　↓43℃のウォーターバスに45秒間いれた

　↓5分間氷冷した

　↓SOC培地を900μl加えた

　↓20分間,37℃のインキュベーターに入れた

　↓13000rpm,4℃,1分間遠心した

　↓培養液を少し捨て量を減らし、ピペッティングした

　LBプレートにまき、37℃のインキュベーターに入れてovernight

Results

(1)　以下のようにサンプルを泳動した

レーン1	1Kb Maker
レーン2	コロニー1から抽出したプラスミド
レーン3	コロニー1から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの
レーン4	コロニー2から抽出したプラスミド
レーン5	コロニー2から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの

レーン2と4で同じ長さのバンドが確認できた

またレーン3と5では2本のバンドが確認でき、3と5で長さに違いはなかった

(2)　RFPのバンドが見られなかった

(3)　全てのプレートでコロニーの生育が見られた

Consideration

(1)　pSB1C3はベクター2072bp・インサート1069bpであり、

インサート部分の両端に今回使用した制限酵素で切断できる部位をもつので

電気泳動の結果と照らし合わせるとどちらのコロニーも目的プラスミドの挿入がなされていると考えられる

これを用いてマスタープレート・グリセロールストックの作成をする

(2)　制限酵素処理に失敗したと思われる

September 6

Time

8:30～20:30

Member

岩城

Iwaki

Purpose

(1)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のプラスミドを抽出する

(2)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)を制限酵素処理する

(3)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のゲル抽出

(4)　RFP・CFP・YFPをpSB1A2からpSB6A1に乗せ換える

AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターをpSB6A1(K121013)のRBSの前に挿入する

Method

(1)　プラスミド抽出

　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)の

　4種のプラスミドの抽出をした(カラムを使用したミニプレップ)

(2)　制限酵素処理

　(1)で抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した

　(1)で抽出したpSB6A1(K121013)を2つに分け、RFP,CFP,YFP用とpromoter用とした

　RFP,CFP.YFP用をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した

　promoter用をEcoRⅠとXbaⅠの2種の制限酵素で切断した

(3)　ゲル抽出

　(2)で制限酵素処理したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の

　インサートと pSB6A1(K121013)のベクターのゲル抽出を行った(青ゲル)

(4)　LigationとTrans formation

　(3)でゲル抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の

　インサートと pSB6A1(K121013)(RFP,CFP,YFP用)のLigationを行った

　前日にゲル抽出済みの AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターと

　(3)でゲル抽出したpSB6A1(K121013)(promoter用)のLigationを行った　

　LigationしたものをTFして、プレートを37℃・overnightでインキュベートした

Results

ゲル抽出の際にpSB1A2(I13507)のバンドが確認できなかったため抽出できなかった

それ以外に関してはTFまで完了した

以下の計5種

　　pSB6A1(E0430)

　　pSB6A1(E0420)

　　pSB6A1(K362007)

　　pSB6A1(K362011)

　　pSB6A1(K362013)

Consideration

試験管3本分ではゲル抽出でバンドがでない可能性が高い

確実にゲル抽出するためには5本以上の試験管での培養が必要と考えられる

September 7

Time

9：00～

Member

岩城、福山、竹内、中村

Iwaki,fukuyama,Takeuchi,Nakamura

Purpose

(1)　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP)),DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP)),

DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP)),DH5α(pSB6A1(SodA,GFP)),

DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))のコロニーをピックアップ [福山]

(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理　[福山]

(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮　[福山]

(4)　AcrABのPCR　[中村]

(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ

(6)　lacZのアルカリミニプレップ

Method

(1)　コロニーをピックアップ

　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP))

　DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP))

　DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP))

　DH5α(pSB6A1(SodA,GFP))

　DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))

　それぞれのコロニーを32個ずつピックアップし、LBプレート(+amp)にストリークした

　↓37℃でインキュベートした

(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理

　PCR処理済みのAcrAB溶液400μlにMilliQ200μl加えた

　↓フェノールクロロホルム溶液を1.2mlほど加えてピペッティングし、vortexした

　↓室温、14,500rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収し、これに2-プロパノールを1.2mlほど加えた

　↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨て、70％エタノールを1.2mlほど加えた

　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した

　↓上清を捨てた

　↓遠心乾燥機で乾燥した

　↓MilliQを30μl加えた

　↓5μlとって2％アガロースゲル電気泳動で確認した(300bpあたりにバンドが見えた)

　↓100倍希釈で吸光度を計測した

　↓濃縮したプラスミド溶液24μlに下表2に従い各試薬を加えた

　↓調整した試料を37℃で一晩インキュベートした

表1: 吸光度計測結果 AD260 0.071 0.069 0.069 0.07 0.071 平均 0.07

表2: 試薬組成 AcrAB 24μl EcoRⅠ 0.84μl PstⅠ 0.933μl H Buffer 2.6μl MilliQ 21.6μl 全量 約50μl

(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮

　DH5α(pSB6A1(promotor less,RFP))を1.5mlエッペンチューブにうつした

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓20℃、14,500rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を回収した

　↓溶出液量に対して酢酸ナトリウムを1/10倍、イソプロパノールを等量加えて混ぜた

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨て、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した

　↓上清を捨て、遠心乾燥機で乾燥した

　↓MilliQを30μl加えた

(4)　AcrABのPCR

　下表1,2に示した試薬組成、設定に従ってPCRを行った

組成 AcrABM 1.5μL Buffer 5μL dNTPs 5μL KOD-Plus 1μL MgSO4 4μL 鋳型DNA 0.5μL H2O 33μL Total 50μL

PCR設定 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60.2℃ 68℃ 68℃ 4℃ 5min 15sec 30sec 20sec 2min ∞ 30サイクル

(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ

　pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ

　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓電気泳動した

(6)　lacZのアルカリミニプレップ

　集菌後、水分を十分に取り除き、SolutionⅠ250μLを加えた

　↓vortexにより混合した後、SolutionⅡ250μLを加え、上下に2，3度転倒させて混ぜた

　↓SolutionⅢ350μLを加え、よく混合した

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min

　↓上清をカラムに移した

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　30sec　カラム下部の液を捨てた

　↓SolutionⅣ500μLを加えた

　↓cfg.　20℃　13,000rpm　1min　カラム下部の液を捨てた

　↓SolutionⅤ700μLを加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　1min×２

　↓酢酸ナトリウム50μL、イソプロパノール800μLを加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　10min

　↓上清を除いた

　↓70%EtOHをエッペンの8分目まで加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min

　↓遠心乾燥　2min

　↓滅菌水100μLに溶かした

Results

(1)　翌日プレート上で各プラスミドを持つ大腸菌が培養出来ているのを確認した

(2)　制限酵素処理が上手くいったかどうかは確認できていない

翌日以降、電気泳動によって確認し、問題がなければゲル抽出する

(3)　どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である

翌日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う

(4)　ゲル抽出をするのに十分な濃度の試料を得ることができた。

(5)　バンドは検出できなかった、iGEMの製作した試薬には問題ありと考えられる

(6)　lacZの吸光度は0,1468（×1/100）でDNA濃度は734g/μLであった

　　　→冷蔵保存

September 8

Time

9：00～

Member

岩城、福山、古道、竹内、中村

Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Purpose

(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮

(2)　pSB6A1（E0420）の培養

(3)　SodA,OxyR,yaiAのPCR

(4)　PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理

(5)　pSB1C3のイソプロ沈

Method

(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮

　4時間ほどLB液体培地で培養した各E.Coliをそれぞれ1.5mlエッペンに8割ほど移した

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して

　　それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。

　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

　↓MilliQを各種プラスミドにつき30μlずつ加えた

(2)　pSB6A1（E0420）の培養

　前日にAmp入りLB寒天培地にストリークしたpSB6A1(E0420)を

　2mlのLB液体培地が入った試験管6本に一部うつして　　　　　

　振とう培養した

(3)　SodA,OxyR,yaiAのPCR

　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を

　すでにMixしたプライマー(SodA, OxyR,yaiA)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた

　↓それぞれのエッペンに下表1の組成で溶液を加えた

　↓下表2,3のプログラムでPCR反応を行った

　↓PCR産物を電気泳動にかけた

表1: 試薬組成
テンプレートDNA(DH5α)	各0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-	5μL
2mM d NTPs	5μL
2mM MgSO4	4μL
MilliQ	33μL
KOD-Plus-	1μL
total	50μL

表2: SodA,OxyRのPCR反応 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 62.7℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min 保持 30サイクル

表3: yaiAのPCR反応 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60.4℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 38sec 2min 保持 30サイクル

(4)　PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理

　PCR済のSodA, OxyR,yaiAにそれぞれ200µlずつ滅菌水を加えた

　↓フェノールクロロホルム(φ OH/CIAA)200µl加えた

　↓4℃、14,000rpmで10min遠心した

　↓上清を回収しそれにクロロホルムイソアミルアルコール(CIAA)を200µl加えボルテックスした

　↓4℃、14,000rpmで10min遠心した

　↓上清を回収しそれに3M CH₃COONaを50µl加え混ぜた

　↓イソプロパノール0.5ml加えて混ぜ4℃、14,000rpmで20min遠心した

　↓上澄みを捨て70％エタノール200µl加え4℃、14,000rpmで10min遠心した

　↓上澄みを捨てて乾燥させた

　↓滅菌水を30µl加えた

　↓冷蔵保存した

(5)　pSB1C3のイソプロ沈

　TEに溶かした状態のpSB1C3ベクター50μLに、CH₃COONa50μL、イソプロパノール800μLを加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　15min

　↓上清を捨てた

　↓70%EtOH800μLを加えた

　↓cfg.　25℃　14,500rpm　5min

　↓EtOHを除いた

　↓遠心乾燥　2min

　↓滅菌水30μLに溶かした

Results

(1)　まだどれほどの量でプラスミドが回収できたのかは分からない

(2) 培養に成功していれば明日にもアルカリミニプレップを行う予定

(3)　PCR産物を電気泳動にかけた結果、すべて、バンドが検出されたので、今後使用するものとする

(4)　実験(3)で得られたPCR産物のクロロホルム処理を行い冷蔵保存した

これを次回の実験に用いる(制限酵素処理など)

(5)冷蔵保存

September 9

Time

9：00～

Member

竹内、中村、吉村

Takeuchi,nakamura,Yoshimura

Purpose

(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出　[吉村]

(2)　(1)と前日(9/8)にプラスミド抽出した

pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出　[吉村]

(3)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定　[中村]

Method

(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出

　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)を1.5mlエッペンチューブにうつした

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓CH₃COONaとイソプロパノールを

　　溶出液量に対してそれぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

　↓MilliQを30μl加えた

(2)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出

　今回は青ゲルを使わずにUV照射でバンドの位置を確認してゲル抽出を行う方法をとった

　DNAを下表1,2,3のように制限酵素処理した

　↓3時間,37℃でインキュベート

　↓アガロースゲルに下表4の全量をapplyした

　↓50V,50minで電気泳動した。

　↓20min EtBrに浸した

　↓暗室でUVをゲルに照射し、バンドの位置を確認してゲルを切り出した

表1: CFP DNA 40μl EcoRⅠ 1.5μl XbaⅠ 1.5μl M Buffer 5μl milliQ 2μl total 50μl

表2: RFP,YFP DNA 30μl EcoRⅠ 1.5μl XbaⅠ 1.5μl M Buffer 5μl milliQ 12μl total 50μl

表3: TetR DNA 30μl EcoRⅠ 1.5μl PstⅠ 1.5μl H Buffer 5μl milliQ 12μl total 50μl

表4: 試薬組成 Marker(1kb) 3μl Loadiing Buffer 10μl DNA 全量

(3)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定

冷蔵保存されていたoxyR、sodA、yaiA on pSB6A1をそれぞれ、100倍希釈で吸光度測定した

Results

(2,3)　CFP,YFP,TetRはバンドが見え、切り出しに成功した

　⇒冷蔵庫に保存、翌日のLigationに使用する

　RFPはバンドが見えなかった

　⇒ミニプレの必要あり

(4)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定結果(100倍希釈)

	吸光度	DNA濃度
oxyR	0.018(5回平均)	90ng/μL
sodA	0.058(5回平均)	290ng/μL
yaiA	0.029(5回平均)	145ng/μL

September 10

Time

9：00～

Member

福山、竹内、臼井、吉村

Fukuyama,Takeuchi,Usui,Yoshimura

Purpose

(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(J04450)の培養　[臼井]

(2)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430)とpSB1A2(R0040)のライゲーション　[吉村]

(3)　ahpC,sufAの活性確認　[臼井]

(4)　全プロモーター(予備は除く)の制限酵素処理　[臼井]

(5)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ、濃縮　[福山]

(6)　OxyRの逆向きのプロモーター活性を調べるためにInverted LacZをPCRにより作成する　[吉村]

Method

(1)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450)の培養

　pSB1A2(I13522),pSB1A2(J04450)をマスタープレートより白金耳でひっかき、

　LB(+amp)の培地3mLで各3本ずつ37℃で培養した

(2)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430)とpSB1A2(R0040)のライゲーション

[1] CFP,RFP,YFP,TetR-GFPのDNAのゲルからの抽出

　切りだしたゲルを入れたエッペンに400μlのmilliQを入れた

　↓65℃でゲルを溶かした

　↓フェノールをエッペンの8割くらいまでいれて、vortexした

　↓14,500rpm,5min,4℃で遠心した

　↓上清を回収し、フェノールクロロホルムをエッペンの8割くらいまで加えた

　↓14,500rpm,5min,4℃で遠心した

　↓上清を回収し、イソプロパノール 800μl,CH₃COONa 50μlを加えた

　↓14,500rpm,10min,4℃で遠心した

　↓70％EtOH 200μlを加えた

　↓14,500rpm,3min,4℃で遠心した

　↓遠心乾燥器にかけた

　↓30μlのmilliQに溶かした後吸光度を測定しDNA濃度を調べた

[2] pSB6A2(k121013)とpSB1A2(I13522)のligation

　ligationはT-4ligaseを用いて以下の条件で行った

A(insert:vector=1:2) Insert(TetR-GFP) 1μl Vevtor(pSB6) 7.8μl Buffer 1μl T-4ligase 1μl MilliQ 0μl Total 10.8μl

B(insert:vector=1:10) Insert(TetR-GFP) 1μl Vevtor(pSB6) 4.2μl Buffer 1μl T-4ligase 1μl MilliQ 3μl Total 10μl

　A、B両サンプルをそれぞれ16℃で1時間インキュベートした

　以上の2サンプルについては以下の条件でトランスフォーメーションを行った

　　DH5α50μlに以上の2サンプル全量を加え混ぜた後、30分間氷上で静置した

　　↓43℃で40秒インキュベートした後、10分間氷上で静置した

　　↓この各サンプルをLBプレート(+amp　終濃度50μg/ml)にまき37℃でインキュベートした(overnight)

(3)　ahpC,sufAの活性確認

　ahpC,sufAに関して100倍希釈の吸光度5回測定し、平均値より各濃度を算出した

ahpC 1回目 0.211 2回目 0.210 3回目 0.204 4回目 0.200 5回目 0.198 Ave 0.2046 濃度1023ng/μL

sufA 1回目 0.161 2回目 0.164 3回目 0.165 4回目 0.160 5回目 0.159 Ave 0.1618 濃度809ng/μL

(4)　全プロモーター(予備は除く)の制限酵素処理

　ahpC(全量240μL),AcrAB(全量45μL),dps(全量195μL),SodA(全量135μL),

　sufA(全量240μL),oxyR(全量45μL),yaiA(全量135μL)の七種類のプロモーターに関して、

　濃縮を以下の手順で行い、制限酵素処理を行った

[濃縮]

　DNA溶液の全量をxμLとして、DNA溶液に1/10x μL　3M CH₃COONa,x μL　isopropanolを加えた

　↓cfg.14000rpm,20min,4℃

　↓上清を捨て、70%EtOHを加えた

　↓cfg.14000rpm,10min,4℃

　↓上清を捨て遠心乾燥 30sec.

　↓それぞれのDNAにH₂O 30μLを加えた

[制限酵素処理]

＜組成＞
DNAサンプル	30μL
10×H-Buffer	4μL(1×として使用)
EcoRⅠ	0.4μL
SpeⅠ	0.2μL
H2O	5.4μL
Total	40μL

　これを37℃,overnightで培養した

(5)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ、濃縮

pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)を

それぞれ別々に1.5mlエッペンチューブにうつした

　↓遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓CH₃COONaとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

　↓TE(10μlTris-HCl pH8.0/1mM EDTA)をそれぞれ30μlずつ加え、冷蔵庫で保管した

(6)　OxyRの逆向きのプロモーター活性を調べるためにInverted LacZをPCRにより作成する

[1]Inverted LacZ 作成のためのPCR

　鋳型DNAとしてiGEMで登録されているpSB1A2(I732019)を用いた

　PCRの条件は以下の条件で行った

Sample A 鋳型DNA(810ng/ul) 0.5ul MgSO4 1ul dNTP 2ul KODplus 0.5ul Primer(forward) 0.5ul Primer(Reverse) 0.5ul Buffer 2ul MilliQ 13ul Total 20ul

Sample B 鋳型DNA(810ng/ul) 0.5ul MgSO4 2ul dNTP 2ul KODplus 0.5ul Primer(forward) 0.5ul Primer(Reverse) 0.5ul Buffer 2ul MilliQ 12ul Total 20ul

PCR反応 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 63℃ 75℃ 75/TD> 4℃ 2min 30sec 30sec 30sec 10min 保持 35サイクル

　合成したプライマーを以下に示した

Primer(forward)	5’-CAGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGTATAAACGCAGAAAGGCCCA
Primer(Reverse)	5’-ACGTACTAGTAGCGGCCGCTGCAGAAAGAGGAGAAATACTAGAT

　以上の条件によりPCRで増幅させたサンプルを電気泳動し、増幅の確認を行った

Results

(1)　翌日、培養の成功を確認した

(2) それぞれのDNA濃度を以下にまとめた

　　　CFP 280ng/μl

　　　YFP 450ng/μl

　　　TetR－GFP 400ng/μl

翌日コロニーができていた

(3) 濃度の測定で十分量と判断し、以後の実験に使用した

(4) 翌日11日に結果記載

(5) どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である

明日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う

(6) Ⅰのサンプルではバンドがみられなかったが、Ⅱのサンプルではバンドが見えた

　　　⇒Ⅱのサンプルでバンドが見られたことから、次回からPCRするにはⅡの条件で行うのがよい

TetR-GFPのインサートが937bpなので、今回得られたバンドは少しそれより長いものと考えられる

急ぎなのでこのまま使用するが、本来ならカットチェックを行う必要がある

September 11