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Template:KIT-Kyoto-week5
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Contents |
September 5
Time
- 9：30～
Member
- 岩城、竹内、吉村
- Iwaki,Takeuchi,Yoshimura
Purpose
- (1) 前日にシングルコロニーピックアップをしたpSB1C3(J04450)を
- 制限酵素処理を行うことにより、目的プラスミドの挿入を確認した
- (2) プロモーター挿入用のpSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507)
- インサートを切り出してI13507の挿入用のpSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出
- (3) ライゲーションとトランスフォーメーション
Method
- (1) pSB1C3のプラスミド抽出と制限酵素処理による確認
- 前日に2つのシングルコロニーをピックアップし2 mlのLB培地(+Cam)で37℃で一晩培養した
- ↓1.5 mlをチューブに採った
- ↓25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓カラムを新しいチューブに乗せ換えた
- ↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- それぞれ10 µlを別のチューブに採った
- ↓H bufferを5 µl加えた
- ↓蒸留水を34 µl加えた
- ↓EcoRⅠとPstⅠを0.5 µlずつ加えた
- ↓37℃で1.5時間インキュベートした
- ↓1 %ゲルを用いて、100 Vで25分間電気泳動した
- ↓20分間EtBrで染色した
- ↓紫外線を照射し写真を撮影した
- (2) pSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出
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- (3) ライゲーションとトランスフォーメーション
- コンピテントセルにDNAを入れた
- ↓20分間氷冷した
- ↓43℃のウォーターバスに45秒間いれた
- ↓5分間氷冷した
- ↓SOC培地を900μl加えた
- ↓20分間,37℃のインキュベーターに入れた
- ↓13000rpm,4℃,1分間遠心した
- ↓培養液を少し捨て量を減らし、ピペッティングした
- LBプレートにまき、37℃のインキュベーターに入れてovernight
Results
- (1) 以下のようにサンプルを泳動した
レーン1 1Kb Maker レーン2 コロニー1から抽出したプラスミド レーン3 コロニー1から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの レーン4 コロニー2から抽出したプラスミド レーン5 コロニー2から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの
- レーン2と4で同じ長さのバンドが確認できた
- またレーン3と5では2本のバンドが確認でき、3と5で長さに違いはなかった
- (2) RFPのバンドが見られなかった
- (3) 全てのプレートでコロニーの生育が見られた
Consideration
- (1) pSB1C3はベクター2072bp・インサート1069bpであり、
- インサート部分の両端に今回使用した制限酵素で切断できる部位をもつので
- 電気泳動の結果と照らし合わせるとどちらのコロニーも目的プラスミドの挿入がなされていると考えられる
- これを用いてマスタープレート・グリセロールストックの作成をする
- (2) 制限酵素処理に失敗したと思われる
September 6
Time
- 8:30～20:30
Member
- 岩城
- Iwaki
Purpose
- (1) pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のプラスミドを抽出する
- (2) pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)を制限酵素処理する
- (3) pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のゲル抽出
- (4) RFP・CFP・YFPをpSB1A2からpSB6A1に乗せ換える
- AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターをpSB6A1(K121013)のRBSの前に挿入する
Method
- (1) プラスミド抽出
- pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)の
- 4種のプラスミドの抽出をした(カラムを使用したミニプレップ)
- (2) 制限酵素処理
- (1)で抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した
- (1)で抽出したpSB6A1(K121013)を2つに分け、RFP,CFP,YFP用とpromoter用とした
- RFP,CFP.YFP用をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した
- promoter用をEcoRⅠとXbaⅠの2種の制限酵素で切断した
- (3) ゲル抽出
- (2)で制限酵素処理したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の
- インサートと pSB6A1(K121013)のベクターのゲル抽出を行った(青ゲル)
- (4) LigationとTrans formation
- (3)でゲル抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の
- インサートと pSB6A1(K121013)(RFP,CFP,YFP用)のLigationを行った
- 前日にゲル抽出済みの AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターと
- (3)でゲル抽出したpSB6A1(K121013)(promoter用)のLigationを行った
- LigationしたものをTFして、プレートを37℃・overnightでインキュベートした
Results
- ゲル抽出の際にpSB1A2(I13507)のバンドが確認できなかったため抽出できなかった
- それ以外に関してはTFまで完了した
- 以下の計5種
- pSB6A1(E0430)
- pSB6A1(E0420)
- pSB6A1(K362007)
- pSB6A1(K362011)
- pSB6A1(K362013)
Consideration
- 試験管3本分ではゲル抽出でバンドがでない可能性が高い
- 確実にゲル抽出するためには5本以上の試験管での培養が必要と考えられる
September 7
Time
- 9：00～
Member
- 岩城、福山、竹内、中村
- Iwaki,fukuyama,Takeuchi,Nakamura
Purpose
- (1) DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP)),DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP)),
- DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP)),DH5α(pSB6A1(SodA,GFP)),
- DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))のコロニーをピックアップ [福山]
- (2) AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理 [福山]
- (3) pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮 [福山]
- (4) AcrABのPCR [中村]
- (5) pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ
- (6) lacZのアルカリミニプレップ
Method
- (1) コロニーをピックアップ
- DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP))
- DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP))
- DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP))
- DH5α(pSB6A1(SodA,GFP))
- DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))
- それぞれのコロニーを32個ずつピックアップし、LBプレート(+amp)にストリークした
- ↓37℃でインキュベートした
- (2) AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理
- PCR処理済みのAcrAB溶液400μlにMilliQ200μl加えた
- ↓フェノールクロロホルム溶液を1.2mlほど加えてピペッティングし、vortexした
- ↓室温、14,500rpmで5分間遠心した
- ↓上清を回収し、これに2-プロパノールを1.2mlほど加えた
- ↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した
- ↓上清を捨て、70％エタノールを1.2mlほど加えた
- ↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した
- ↓上清を捨てた
- ↓遠心乾燥機で乾燥した
- ↓MilliQを30μl加えた
- ↓5μlとって2％アガロースゲル電気泳動で確認した(300bpあたりにバンドが見えた)
- ↓100倍希釈で吸光度を計測した
- ↓濃縮したプラスミド溶液24μlに下表2に従い各試薬を加えた
- ↓調整した試料を37℃で一晩インキュベートした
表1: 吸光度計測結果 AD260 0.071 0.069 0.069 0.07 0.071 平均 0.07 表2: 試薬組成 AcrAB 24μl EcoRⅠ 0.84μl PstⅠ 0.933μl H Buffer 2.6μl MilliQ 21.6μl 全量 約50μl
- (3) pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮
- DH5α(pSB6A1(promotor less,RFP))を1.5mlエッペンチューブにうつした
- ↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓20℃、14,500rpmで5分間遠心した
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
- ↓溶出液を回収した
- ↓溶出液量に対して酢酸ナトリウムを1/10倍、イソプロパノールを等量加えて混ぜた
- ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
- ↓上清を捨て、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
- ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
- ↓上清を捨て、遠心乾燥機で乾燥した
- ↓MilliQを30μl加えた
- (4) AcrABのPCR
- 下表1,2に示した試薬組成、設定に従ってPCRを行った
組成 AcrABM 1.5μL Buffer 5μL dNTPs 5μL KOD-Plus 1μL MgSO4 4μL 鋳型DNA 0.5μL H2O 33μL Total 50μL PCR設定 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60.2℃ 68℃ 68℃ 4℃ 5min 15sec 30sec 20sec 2min ∞ 30サイクル
- (5) pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ
- pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ
- 25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
- ↓電気泳動した
- (6) lacZのアルカリミニプレップ
- 集菌後、水分を十分に取り除き、SolutionⅠ250μLを加えた
- ↓vortexにより混合した後、SolutionⅡ250μLを加え、上下に2，3度転倒させて混ぜた
- ↓SolutionⅢ350μLを加え、よく混合した
- ↓cfg. 25℃ 13,000rpm 5min
- ↓上清をカラムに移した
- ↓cfg. 25℃ 13,000rpm 30sec カラム下部の液を捨てた
- ↓SolutionⅣ500μLを加えた
- ↓cfg. 20℃ 13,000rpm 1min カラム下部の液を捨てた
- ↓SolutionⅤ700μLを加えた
- ↓cfg. 25℃ 13,000rpm 1min×２
- ↓酢酸ナトリウム50μL、イソプロパノール800μLを加えた
- ↓cfg. 25℃ 13,000rpm 10min
- ↓上清を除いた
- ↓70%EtOHをエッペンの8分目まで加えた
- ↓cfg. 25℃ 13,000rpm 5min
- ↓遠心乾燥 2min
- ↓滅菌水100μLに溶かした
Results
- (1) 翌日プレート上で各プラスミドを持つ大腸菌が培養出来ているのを確認した
- (2) 制限酵素処理が上手くいったかどうかは確認できていない
- 翌日以降、電気泳動によって確認し、問題がなければゲル抽出する
- (3) どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である
- 翌日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う
- (4) ゲル抽出をするのに十分な濃度の試料を得ることができた。
- (5) バンドは検出できなかった、iGEMの製作した試薬には問題ありと考えられる
- (6) lacZの吸光度は0,1468（×1/100）でDNA濃度は734g/μLであった
- →冷蔵保存
September 8
Time
- 9：00～
Member
- 岩城、福山、古道、竹内、中村
- Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Nakamura
Purpose
- (1) pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮
- (2) pSB6A1（E0420）の培養
- (3) SodA,OxyR,yaiAのPCR
- (4) PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理
- (5) pSB1C3のイソプロ沈
Method
- (1) pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮
- 4時間ほどLB液体培地で培養した各E.Coliをそれぞれ1.5mlエッペンに8割ほど移した
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓溶出液を回収
- ↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して
- それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
- ↓遠心10分(4℃、14,000rpm)
- ↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。
- ↓遠心5分(4℃、14,000rpm)
- ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
- ↓MilliQを各種プラスミドにつき30μlずつ加えた
- (2) pSB6A1（E0420）の培養
- 前日にAmp入りLB寒天培地にストリークしたpSB6A1(E0420)を
- 2mlのLB液体培地が入った試験管6本に一部うつして
- 振とう培養した
- (3) SodA,OxyR,yaiAのPCR
- プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を
- すでにMixしたプライマー(SodA, OxyR,yaiA)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた
- ↓それぞれのエッペンに下表1の組成で溶液を加えた
- ↓下表2,3のプログラムでPCR反応を行った
- ↓PCR産物を電気泳動にかけた
表1: 試薬組成 テンプレートDNA(DH5α) 各0.5μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus- 5μL 2mM d NTPs 5μL 2mM MgSO4 4μL MilliQ 33μL KOD-Plus- 1μL total 50μL
表2: SodA,OxyRのPCR反応 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 62.7℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min 保持 30サイクル 表3: yaiAのPCR反応 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60.4℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 38sec 2min 保持 30サイクル
- (4) PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理
- PCR済のSodA, OxyR,yaiAにそれぞれ200µlずつ滅菌水を加えた
- ↓フェノールクロロホルム(φ OH/CIAA)200µl加えた
- ↓4℃、14,000rpmで10min遠心した
- ↓上清を回収しそれにクロロホルムイソアミルアルコール(CIAA)を200µl加えボルテックスした
- ↓4℃、14,000rpmで10min遠心した
- ↓上清を回収しそれに3M CH3COONaを50µl加え混ぜた
- ↓イソプロパノール0.5ml加えて混ぜ4℃、14,000rpmで20min遠心した
- ↓上澄みを捨て70％エタノール200µl加え4℃、14,000rpmで10min遠心した
- ↓上澄みを捨てて乾燥させた
- ↓滅菌水を30µl加えた
- ↓冷蔵保存した
- (5) pSB1C3のイソプロ沈
- TEに溶かした状態のpSB1C3ベクター50μLに、CH3COONa50μL、イソプロパノール800μLを加えた
- ↓cfg. 25℃ 13,000rpm 15min
- ↓上清を捨てた
- ↓70%EtOH800μLを加えた
- ↓cfg. 25℃ 14,500rpm 5min
- ↓EtOHを除いた
- ↓遠心乾燥 2min
- ↓滅菌水30μLに溶かした
Results
- (1) まだどれほどの量でプラスミドが回収できたのかは分からない
- (2) 培養に成功していれば明日にもアルカリミニプレップを行う予定
- (3) PCR産物を電気泳動にかけた結果、すべて、バンドが検出されたので、今後使用するものとする
- (4) 実験(3)で得られたPCR産物のクロロホルム処理を行い冷蔵保存した
- これを次回の実験に用いる(制限酵素処理など)
- (5)冷蔵保存
