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From 2010.igem.org

August 18

Time

9:00～

Member

岩城、古道、竹内、中村

Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Purpose

(1)　pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る　[中村]

(2)　pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る　[中村,革島]

(3)　作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認　[古道]

(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション　[中村]

(5)　19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する　[岩城]

(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養　[革島]

(7)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ　[竹内]

Method

(1)　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク

　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート（+amp）にストリーク

　↓37℃でインキュベート（Overnight）

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク

　pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート（+amp）にストリーク

　↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)

(3)コンピタントセルの調整（17日の続き）

　前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした

　↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した

　↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した

　↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた

　↓O.D＝0.4～0.8になるように調節した

(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション

　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした

　↓37℃でインキュベート(Overnight)

(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー

　pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした

　↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養

(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養

　前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋Cam）に大量培養

(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミディプレ

　大量培養させておいたpSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した

　↓比重計で、それぞれ等量を量った

　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した

　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした

　↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した

　↓N3 4mLを加えた

　↓室温、12,000rpmで10min遠心した

　↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた

　↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×２)

　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した

＊以降の操作は翌日に繰り越した

Result

19日に確認を行った結果を以下に示す

(1)　psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった

(3)　次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた

(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、

前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた

(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了

(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了

(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミニプレ

　　→吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。

Consideration

(1)　pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。

これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる

(2)　pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる

(3)翌日、吸光度を測定する

(4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。

pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。