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From 2010.igem.org

August 13

Time

9:00～21:00

Member

岩城,竹内,中村,吉村,足立

Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Yoshimura,Adachi

Purpose

1. pSB3K3 transformed into the competent cells(DH5Alpha) convincingly onto a LB(+kan) plate.
2. Miniprep pSB1A2(J44000),pSB6A1(J04450) from 12/8
3. Digested these and Ran on a Gel

• pSB1A2(J44000)
• pSB6A1(J04450)

(1)　12日にLB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする

(2)　前日に培養したpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のプラスミド抽出

(3)　DH5αに目的プラスミドpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)が挿入されているか制限酵素処理をすることによって確かめる

Method

(1)　pSB3K3(J04450)のトランスフォーメーション

　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した

　↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した

　↓on　ice　30min

　↓45℃で45sec、過熱した

　↓on　ice　2min

　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた

　↓37℃で1h、振とう培養した

　↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight

(2)　pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のミニプレップ

　培養後のpSB1A2(J44000)とpSB6A1(J04450)を1.5mLチューブに取った

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)

　↓5min on ice

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)

　↓5min on ice

　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した

　↓上澄みを捨てた

　↓30秒間遠心乾燥を行った

　↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした

(3)　pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)の制限酵素処理と電気泳動

pSB1A2(J44000) pSB6A1(J04450) XbaⅠ,PstⅠ 1μL - EcoRⅠ,SpeⅠ - 1μL (2)で得たpSB1A2 プラスミド 5μL - (2)で得たpSB6A1 プラスミド - 5μL H2O 11μL 11μL H Buffer 1μL 2μL M Buffer 1μL - 計 20μL 20μL

右の組成で1.5mlチューブ内で混合した 37℃で1時間インキュベートした ↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した 　(マーカーは1kbp radderを使用した) ↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した ↓泳動結果を写真で撮影した

Result

(1)　　2つのコロニーの生育を確認した(ピンク)

(2,3)　pSB6A1(J04450)→2本のバンドが確認できたことにより、目的プラスミドの挿入が確認できた

　pSB1A2(J44000)→バンドが検出できなかった

Consideration

(1)

(2,3)　翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る

　翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う