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From 2010.igem.org

August 20

Time

9:00～

Member

福山、古道、竹内、革島

Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Kawashima

Title

(1)　8/19(木)に作ったコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測　[古道]

(2)　pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)を翌日以降培養するための種培養　[革島]

(3)　pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ　[福山]

(4)　pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出　[福山、竹内]

Purpose

(1)　作成したコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測

(2)　pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)を翌日以降培養するための種培養

(3)　pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のプラスミドDNAの抽出

(4)　pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

Method

(1)　コンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測

　8/19(木)に以下の条件で形質転換を行い、

　コンピタントセル(DH5α)をLB培地(+amp)で37℃,overnightで培養した

　　　pUC19・・・・・0.005ng/μL

　　　pUC19・・・・・0.05ng/μL

　　　pUC19・・・・・0.5ng/μL

　↓これらのプレートに出たコロニー数を数え形質転換の効率を計測した

(2)　pSB1A2(I13522)とpSB1A2(R0040)のプレカルチャー

　pSB1A2(I13522)を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)

　pSB1A2(R0040) を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)

(3)　pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ

　培養後のpSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)を1.5mLとった

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)

　↓5min on ice

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)

　↓5min on ice

　↓4℃、15,000rpmで10分間遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、15,000rpmで10分間遠心した

　↓上澄みを捨てた

　↓30秒間遠心乾燥を行った

　↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした

(4)　pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

　＜材料＞

　　　プラスミドDNA(pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)

　　　1％アガロースゲル　Seakem GTG Agarose 2枚

　　　TAE Buffer

　　　Buffer QG

　　　Isopropanol

　50Vで60分間電気泳動を行った

　↓1％アガロースゲルにEtBrを添加し20分間染色した

　↓EtBrを取り除いた

　↓暗室、UV照射下でゲルのベクター部分を切り出した

　↓切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った

　　　　pSB6A1(J04450)・・・・・0.1923g

　　　　pSB3K3(J04450)・・・・・0.3637g

　↓ゲルの3倍量のBuffer QGを加えた

　　　　pSB6A1(J04450)・・・・・0.5769mL

　　　　pSB3K3(J04450)・・・・・1.0911mL

　↓50℃のwater bathで10分間incubateした(4分毎にvoltex)

　↓溶解後ゲルと等量のisopropanolを加えた

　↓カラムに移し替え、10,000rpmで1分間遠心した

　↓抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた

　↓10,000rpmで1分間遠心した

　↓Buffer PE 0.75ｍLを加えた

　↓10,000rpmで1分間遠心した

　↓エッペンの蓋を切りそこにカラムを移し替えた

　↓1,000rpmで1分間遠心した

　↓別のエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた

　　(このエッペンの蓋は切っていない。)

　↓10,000rpmで1分間遠心した

　↓別のチューブに5μL取り、そこにMilliQ 95μL加え20倍希釈した

Result

(1)　測定したコロニー数

pUC19	0.005ng/μL	0個
pUC19	0.05ng/μL	97個	→1μLあたりのコロニー数は1940×103個/μg
pUC19	0.5ng/μL	1464個	→1μLあたりのコロニー数は2928×103個/μg
			平均値：2.4×106CFU/μg(DH5αのコンピテンシー)

(2)　十分な増殖が確認できた

(3)　後日の電気泳動写真から十分な量のプラスミド抽出できたことが確認できた

(4) 十分な濃度の抽出を行うことができなかった

Consideration

(4)　濃縮作業がうまくいかなかったことが主要原因の一つであると考えられる

具体的には遠心時間が１０分では足りないと考えられる

あるいは培養した大腸菌がすでにプラスミドを失って可能性がある

これより、遠心時間は１０分より長くし、培養した試料を遅くとも翌日までには使うべきであると考えられる