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Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September24
From 2010.igem.org
since 13 Jul 2010
since 1 Aug 2010
- Arac+RBS+pSB1A3保有株のminiprep
- miniprep後のサンプル泳動
Arac+RBS+pSB1A3保有株のminiprep
- 昨日懸濁しておいた菌を1 mLずつ1.5 mLチューブ2本に分注した。
- 4C,15000rpm,1minで遠心した。
- 上澄みを捨て、4Cで保存しておいたBuffer P1をそれぞれ125 uLずつ入れ、Voltexで撹拌した。
- Buffer N3を175 uLずつ入れ、すぐに転倒混和した。
- 4C,13000rpm,10min遠心した。
- 上澄みをデカントでカラムに移し、4C,13000rpm,1minで遠心した。
- 下澄み液を捨て、500 uLのBuffer PBを添加して、4C,13000rpm,1minで遠心した。
- 下澄みを捨て、さらに1min遠心した。
- 新しい1.5 mLチューブにカラムを移し、TEを50 uL入れ1min放置した後、1min遠心した。
miniprep後のサンプル泳動
１ uLのサンプルとloading buffer1 uL混ぜ、6 uLのλ/Hind Ⅲ EcoRⅠとともに泳動した。
マーカーとの比較からこのプラスミドは7000bp位の大きさだと思われる。
Arabinose Promoter+RBS+pSB1A3のbp数が3455bpなので、パーツ及びベクターを2個ずつ含むプラスミドであると考えられる。
この写真から、プラスミド溶液の濃度は30 ng/uL と推定した。
plasmidとGFP+double terminatorのdigestion
以下の組成で試薬を調整した。
| Reagent | Amount |
|---|---|
| DW | 5.6 uL |
| 10x H Buffer | 1 uL |
| 0.1% BSA | 1 uL |
| Spe I | 0.2 uL |
| Pst I | 0.2 uL |
| plasmid | 2 uL |
| Total | 10 uL |
| Reagent | Amount |
|---|---|
| DW | 34 uL |
| 10x M Buffer | 5 uL |
| 0.1% BSA | 5 uL |
| Xba I | 4 uL |
| Pst I | 0.4 uL |
| GFP+double terminator | 1.6 uL |
| Total | 50 uL |
- 37C,1hour置いた。
- Mycrocon YM-10を使って切れ端の除去を行う。sampleが500 uLになるようにTEを加え、カラムに移した。
- 4C,14000g,1hour遠心した。
- 上澄みが30 uL前後残ったので、それを新しいcollection tubeに移し、カラムを逆さまにして挿入した。
- 4C,1000g,3min遠心した。
- GFP+double terminatorが30 uL、plasmid25 uL回収できたので、各1/10量の3M CH3COONaを加えた。
- 100%EtOHを回収量の2.5倍量加え、voltexにかけた。
- 4C,15000rpm,10min遠心した。
- 上澄みを捨て、70%EtOHを500 uL加え、voltexにかけた。
- 4C,15000rpm,5min遠心した。
- 上澄みを捨て、真空装置へ入れよく乾燥させた。
- 2 uLのTEで溶かした。
- -20Cで凍結保存した。
Transformation of BAC Vector
- Used DH5Alpha and MG1655 strains for electroporation
- Plated at 19:15
- Will be incubated for 18 h
