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From 2010.igem.org

August 30

【時間】

9:00～

【実験担当】

岩城,福山,古道,吉村,足立

【実験目的】

(1)　pSB6A1(BBa_K121013:plomotor less)

pSB6A1(BBa_K121013:ahp)

pSB6A1(BBa_K121013:sufA)

のアルカリミニプレップ,電気泳動によるバンド大きさの確認

(2)　pSB6A1(BBa_K121013)のゲル抽出・ライゲーション

(3)　ahpC,OxyR,SodA,SufAのPCR

(4)　前日やり残したpSB6A1(BBa_K121013)のフェノールクロロホルム処理の続きと電気泳動

(5)　培養したSufA(GFP on pSB6A1 K121013)に過酸化水素を加え顕鏡

【実験内容】

(1)　アルカリミニプレップ,電気泳動によるバンド大きさの確認

前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに８割ほど移した 　↓20℃、14500rpmで1分間遠心して集菌した 　↓上清を捨てた 　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした 　↓SolutionⅡを250μl加えた 　↓SolutionⅢを350μl加えた 　↓20℃、14500rpmで5分間遠心した 　↓上清をカラムに入れた 　↓20℃、14500rpmで30秒間遠心した 　↓抽出液を捨てた 　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた 　↓20℃、14500rpmで1分間遠心した 　↓抽出液を捨てた 　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた 　↓20℃、14500rpmで30秒間遠心した 　↓抽出液を捨てた 　↓20℃、14500rpmで30秒間遠心した 　↓抽出液を捨てた 　↓滅菌水をカラムに入れた 　↓20℃、14500rpmで30秒間遠心した 　↓溶出液を回収 　↓右の表のように２種類の溶液を作成し、それぞれ10μlずつとって2μlの 　　loading dyeを加え、135Vで15分間電気泳動をした

溶液1 溶液2 DNA溶液 10μl 10μl bufferM 2μl 2μl EcoRⅠ 0.5μl SpeⅠ 0.5μl 1μl MilliQ 7μl 7μl 全量 20μl 20μl

(2)　pSB6A1(BBa_K121013)のゲル抽出・ライゲーション

　(1)で制限酵素処理をしたものを2.5時間37℃でインキュベートした

　↓CIAPを3μl加え、25分間37℃でインキュベートした

　↓Orange Loading Dyeを加え、青ゲルにapplyした

　↓電気泳動した

　↓バンドのある部分のゲルを切り出し、エッペンに入れた

　↓エッペンに400μlの滅菌水を加え、60~80℃で6分間加熱した

　↓フェノールをエッペンの8割くらいまで加え、ボルテックスした

　↓4℃,14500rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収し、回収した上清にフェノクロをエッペンの8割くらいまで加えた

　↓4℃,14500rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収し、酢酸ナトリウムを50μl、2-プロパノールを800μl加えた

　↓4℃,14500rpmで10分間遠心した

　↓70%エタノールをエッペンの8割くらいまで加えた

　↓上清を捨て、遠心乾燥機にかけて乾燥させた

　↓滅菌水を10μl加え、Quick Ligase Reaction Bufferを10μl加えた

　↓リガーゼを1μl加え、5分間室温で放置した

　↓全量をコンピテントセルに加えた

　↓20分間氷冷

　↓45秒間43℃でヒートブロック

　↓5分間氷冷した

　↓SOC培地を900μl加えた

　↓37℃で20分間インキュベートした

　↓4℃,13000rpmで1分間遠心した

　↓培養液を少し捨て、量を減らしてピペッティングした

　↓LBプレートにまいた

　↓37℃でインキュベートした(overnight)

(3)　ahpC,OxyR,SodA,SufAのPCR

　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を

　すでにMixしたプライマー(ahpC,OxyR,SufA,SodA)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた

　↓それぞれのエッペンに下に示した組成で溶液を加えた

　↓下に示したプログラムでPCR反応を行った

　↓PCR産物を電気泳動にかけ今後使えるかどうかチェックした

テンプレートDNA(DH5α) 各0.5μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus- 5μL 2mM d NTPs 5μL 2mM MgSO₄ 4μL MilliQ 33μL KOD-Plus- 1μL

(ahpC, OxyR，SufA，SodA) 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 59.5℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min 保持 30サイクル

(4)　pSB6A1(BBa_K121013)のフェノールクロロホルム処理の続きと電気泳動

　↓遠心、4℃、14000rpm、20min

　↓なぜか2層になってしまったので上清を回収し3MCH₃COONaを50µl加え混ぜた

　↓イソプロパノールを0.4ml加え混ぜ、4℃、14000rpm、10minで遠心した

　↓また2層になったので再び上清を回収して、4℃、14000rpm、10minで遠心した

　↓上清を捨て、沈殿に70％エタノール200µl加え、4℃、14000rpm、10minで遠心した

　↓乾燥させ、10µgRNase入りTEを30µl加えて冷蔵(4℃)保存した

　↓電気泳動をかけて今後使用できるものか確認した

(5)　培養したSufA(GFP on pSB6A1 K121013)に過酸化水素を加え顕鏡

　アンピシリン入りLB液体培地 2mlにSufA(GFP on pSBA1 K121013)を白金耳でプレカルチャーし、

　　37℃で6時間振とう培養した

　↓培養したSufA(GFP on pSB6A1 K121013)500µlに400mM H₂O₂を5µlを加え、菌にストレスを与えた

　↓5min、室温、放置した

　↓10000rpmで1分間遠心した

　↓上清を捨て滅菌水で洗浄し再び10000rpmで1分間遠心した

　↓上清を捨て、沈殿を用いて顕微鏡観察した

【実験結果】

(1)　pSB6A1(BBa_K121013:plomotor less)

　　　EcoRⅠ、SpeⅠで切断→バンドが3本見られた

　　　SpeⅠのみで切断→2本ずつバンドが見られた

pSB6A1(BBa_K121013:ahp)

　　　EcoRⅠ、SpeⅠで切断→4kbと1kbあたりにバンドが1本ずつ見られた

　　　SpeⅠのみで切断→4kb~5kbあたりのところに1本バンドが見られた

pSB6A1(BBa_K121013:sufA)

　　　EcoRⅠ、SpeⅠで切断→4kbと1kbあたりにバンドが1本ずつ見られた

　　　SpeⅠのみで切断→4kb~5kbあたりのところに1本バンドが見られた

(2)　翌日、コロニーが確認できた

(3)　電気泳動の結果PCR産物はすべてバンドが検出されていたため今後使用できるものと判断した

(4)　電気泳動の結果バンドは一切検出されなかった

(5)　過酸化水素を加えていないコントロールもともと光っていたため、

比過酸化水素を加えた方のGFPによる光の強度にあまり差が見られなかった

【考察】

(1)　pSB6A1(BBa_K121013:plomotor less)については、

カットチェックの結果、いずれも予想より1本ずつバンドが多い結果となった。

このベクターは使わないほうが良いかもしれない

(4)　前日のフェノールクロロホルム処理の続きで遠心をかけて2層になってしまったのは、

前日の手順でフェノールを加え遠心した後に上清を回収し忘れたものではないか、

またイソプロパノールをきちんと加えたのかが疑わしい