"

From 2010.igem.org

August 18

【時間】

9:00～

【実験担当】

岩城、古道、竹内、中村

【実験名】

(1)　BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のストリーク

(2)　BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク

(3)　コンピタントセルの調整(17日の続き)

(4)　l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション

(5)　pSB3K3、pSB6のプレカルチャー(前日の大量培養がコンタミした為)

(6)　pSB1A2の大量培養

(7)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ

【実験目的】

(1)　BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のシングルコロニーを得る

(2)　BBa-1732019、BBa-1732950のシングルコロニーを得る

(3)　作成したコンピタントセルの形質転換率の確認

(4)　l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション

(5)　19日以降、pSB3K3、pSB6を大量培養する

(6)　pSB1A2の大量培養

(7)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ

【実験内容】

(1)　BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のストリーク

　BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)をLBプレート(+amp)にストリークした

　↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)

(2)　BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク

　BBa-1732019、BBa-1732950をLBプレート(+amp)にストリークした

　↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)

(3)　コンピタントセルの調整

　前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした

　↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した

　↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した

　↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた

　↓O.D＝0.4～0.8になるように調節した

(4)　l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション

　l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)をDH5αにトランスフォーメーションした

　↓37℃でインキュベート(Overnight)

(5)　pSB3K3、pSB6のプレカルチャー

　pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした

　↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Km)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養

(6)　pSB1A2の大量培養

　前日2mLで振とう培養していたpSB1A2及びpSB1C3を、それぞれLB培地(+amp)30mL、LB培地(＋ｸﾛﾗﾑﾌｪﾆｺｰﾑ)に大量培養

(7)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ

　大量培養させておいたpSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した

　↓比重計で、それぞれ等量を量った

　↓各チューブを4℃、4000×gで10min　遠心した

　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓沈殿にR3を4mLを加えてVortexを行った

　↓L7を4mLを加え、やさしく混合し、5min室温放置した

　↓N3を4mLを加えた

　↓室温、12,000×gで10min遠心した

　↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた

　↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×２)

　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した

＊以降の操作は翌日に繰り越した

【実験結果】

19日に確認を行った結果を以下に示す

(1)　BBa-K121013に関しては、シングルコロニーが得られたが、BBa-K193602はシングルコロニーが得られなかった

(2)　BBa-1732019、BBa-1732950を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった

(3)　次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた

(4)　R0040(1-6I)、I13522[2-(8A)]をトランスフォーメーション後、培養した結果、

前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた

(5)　pSB3K3、pSB6のプレカルチャー→培養完了

(6)　pSB1A2の大量培養→培養完了

(7)　pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ→電気泳動で確認

＊写真参照

【考察】

(1)　BBa-K193602は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかった

これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったと考えられる

(2)　BBa-1732019、BBa-1732950についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる

(4)　R0040（1-6I）が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる

I13522[2-(8A)]に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある