Template:KIT-Kyoto-Augsut18

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August 18

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【時間】　9:00～

【実験担当】岩城、古道、竹内、中村

【実験名】 (1)BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）のストリーク (2)BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク (3)コンピタントセルの調整（17日の続き） (4)l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）のトランスフォーメーション (5)pSB3K3、pSB6のプレカルチャー（←前日の大量培養がコンタミした為） (6)pSB1A2の大量培養

(7)pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ

【実験目的】 (1)BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）のシングルコロニーを得る (2)BBa-1732019、BBa-1732950のシングルコロニーを得る (3)作成したコンピタントセルの形質転換率の確認 (4)l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）のトランスフォーメーション (5)19日以降、pSB3K3、pSB6を大量培養する (6)pSB1A2の大量培養 (7)pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ

【実験内容】 (1)BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）をLBプレート（+amp）にストリーク 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　37℃でインキュベート（Overnight）

(2)BBa-1732019、BBa-1732950をLBプレート（+amp）にストリーク 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　37℃でインキュベート（Overnight）

(3)前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした 　　　　　　　　　　↓ 　　SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養 　　　　　　　　　　↓ 　　その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養 　　　　　　　　　　↓ 　　吸光度測定した（＊実際は牛島さんに測っていただいた）

(4)l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）をDH5αにトランスフォーメーションした 　　　　　　　　　　　　　↓ 　　37℃でインキュベート（Overnight）

(5)pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした 　　　　　　　　　　　　　↓ 　　pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地（l）（+Km）、LB培地（l）（+amp）に植え継ぎ、37℃で振とう培養

(6)前日2mLで振とう培養していたpSB1A2及び、pSB1C3を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋ｸﾛﾗﾑﾌｪﾆｺｰﾑ）に大量培養

(7)大量培養させておいたpSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した 　　　　　　　　　↓ 　　比重計で、それぞれ等量を量った 　　　　　　　　　↓ 　　各チューブを4℃、4000×gで10min　遠心 　　　　　　　　　↓ 　　この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した 　　　　　　　　　↓ 　　遠心後、上清を捨てた 　　　　　　　　　↓ 　　沈殿にR3 4mLを加えて、Vortex 　　　　　　　　　↓ 　　L7 4mLを加え、やさしく混合し、5min室温放置 　　　　　　　　　↓ 　　N3 4mLを加えた 　　　　　　　　　↓ 　　室温、12,000×gで10min遠心 　　　　　　　　　↓ 　　上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた 　　　　　　　　　↓ 　　カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した（×２） 　　　　　　　　　↓ 　　カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した ＊以降の操作は翌日に繰り越し