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From 2010.igem.org

Apo-Control

Das Team „Apo-Control“ besteht aus 12 Studenten aus dem Fachbereich Biologie. Wir haben uns vorgenommen zwei Unterprojekte zu realisieren, welche mit Apoptose, dem kontrollierten Zelltod arbeiten. Das Ziel ist jeweils die Selektion von Zellen, welche ein Zielgen exprimieren gegenüber Zellen, die dies nicht tun, weil sie zum Beispiel das entsprechende Plasmid nicht aufgenommen haben. Die Zellen, welche das Zielgen nicht exprimieren sterben daraufhin.

Beim „TEV-System“ soll ein Apoptose-auslösendes Protein (Bak) abgebaut werden und gleichzeitig ein Zielgen exprimiert werden. Das funktioniert wie in der Abbildung dargestellt. Bak wird mit interagierendem Protein A, N-Degron und TEV-Schnittstelle verbunden. An eGFP wird ebenfalls eine TEV-Schnittstelle und die TEV-Protease angehängt. Nun fügen sich die interagierenden Proteine zusammen, dadurch schneidet die TEV-Ptorease an den Schnittstellen und das N-Degron hat einen freien N-Terminus (=Abbausignal in Zellen) und der ganze Proteinkomplex inklusive Bak, exklusive dem Zielgen wird abgebaut. Das Kontrukt mit Bak soll stabil in das Zellgenom eingebaut werden, was durch Antibiotikaresistenz selektiert wird.

Für das „Jump-in-System“ wird ein bestimmtes DNA Konstrukt in das eukaryotische Genom eingebaut und mit Antibiotikaresistenz selektiert. Diese Sequenz codiert für einen induzierbaren Promoter, eine „Insert-Sequenz 1“ und ein Apoptose-auslösendes Gen (Bax). Das Zielgen wird in einen Vektor mit „Insert-Sequenz 2“ und einem Stopcodon aber ohne Promotor eingebracht. Wenn die Zellen nun das Plasmid aufnehmen, bewirkt eine Integrase den Einbau des Zielgens an die Stelle der „Insert-Sequenz 1“. Da im Genom schon ein Promotor eingebaut ist, kann das Zielgen nun abgelesen werden, durch das Stopcodon jedoch nicht das nachfolgende Apoptose-auslösende Gen. In Zellen, wo die Integration des Zielgens ins Genom nicht fuktioniert hat, wird das Pro-Apoptotische Gen abgelesen un die Zelle stirbt.

Für die Projekte haben wir uns jeweils folgende „Meilensteine“ gesetzt: „Split-Ubiquitin-System“:

1) Verknüpfen von Bak mit interagierendem Protein A, einem N-Degron und einer Schnittstelle für die TEV-Protesase, sodass Bak noch aktiv bleibt. Davor ist ein induzierbarer Promotor und eine Antibiotikaresistenz geschaltet (Nachweis: induzierbarer Zelltod) Aufwand: ca. 6-8 Wochen, 2000€

2) Verknüpfen von eGFP als Zielgen mit einer TEV-Schnittstelle, einer TEV-Protease, und interagierendem Protein B. (Nachweis: eGFP leuchtet, Proteinchromatographie) Aufwand: ca. 6-8 Wochen, 2000€

Parallele Arbeit ist möglich und notwendig

3) Einbringen beider Konstrukte in Zellen (Nachweis: eGFP leuchtet, einige Zellen sterben, Proteinchromatographie) Aufwand: ca. 2 Wochen, 1000€

4) Parallel wird versucht, das erste Konstrukt stabil ins Zellgenom einzubauen. Aufwand: ca. 2 Wochen, 500€

„Jump-in-System“:

1) Bau des in die Zelle zu integrierenden Kontrukts: Antibiotikaresistenz mit Promotor, ein weiterer induzierbarer Promotor, Insert-Sequenz 1, proapoptotisches Gen (Bax) (Nachweis: induzierbare Apoptose) Aufwand: 3-4Wochen, 2000€

2) Integration des Konstruktes in Zellen (Nachweis: Antibiotikaresistenz nach einigen Tagen) Aufwand: 2-4Wochen, 1500€

3) Konstruktion des Zielgenvektors mit Insert-Sequenz 2, eGFP als Zielgen und einem Stopcodon (Nachweis: nicht einzeln möglich) Aufwand: 2 Wochen, 500€ Parallele Arbeit ist möglich und notwendig

4) Transfektion der Zellen mit integriertem Konstrukt mit dem Zielgenvektor. Einbau des Zielgens ins Genom (Nachweis: Induzierter Zelltod bei nicht-Integration, Zielgennahweis bei Integration) Aufwand: 2 Wochen, 1000€