Template:KIT-Kyoto-week7
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Contents[hide] |
September 19
Time
- 10:00~
Member
- 古道、竹内、臼井
- Furumichi,Takeuchi,Usui
Purpose
- Measurement of promoter activity of yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 and promoterless pSB6A1.[Furumichi]
- Isolation of AcrAB,dps,oxyR,ahpC,sufA and SodA from agarose gel and DNA ligation amd transform into the competent cells. [Usui]
- Picking up single colony of dps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3.[Furumichi]
- Cultivate of dps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3.[Furumichi]
- Cultivate of AhpC GFP on pSB6A1、Suf GFP on pSB6A1、SodA GFP on pSB6A1、yaiA GFP on pSB6A1,promoterless GFP on pSB6A1.[Furumichi]
- (1) yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定 [古道]
- (2) AcrAB,dps,oxyR,ahpC,sufA,SodAの電気泳動
- →ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション [臼井]
- (3) DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3
- のコロニーをピックアップ、ストリーク [古道]
- (4) (3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養 [古道]
- (5) AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1
- プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養 [古道]
Method
- (1) yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1のプロモーター活性の測定
- <材料>
- 培養済みyaiA on pSB6A1
- SufA on pSB6A1
- ahpC on pSB6A1
- プロモーターレスpSB6A1
- 各濃度のH2O2(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)
- 1xPBS
- <方法>
- 培養済yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1を
- アンピシリン入りLB液体培地を用いて20倍希釈した
- ↓吸光度測定した
- ↓その20倍希釈yaiA on pSB6A1,SufA on pSB6A1,ahpC on pSB6A1 ,プロモーターレスpSB6A1 500μlに
- 各濃度のH2O2(1M,100mM,10mM,1mM,100μM,10μM,1μM)0.5μlを加え混ぜた
- ↓37℃、30min、振とう培養した
- ↓4℃、14,000rpm、3minで遠心し集菌し、上清を除いた
- ↓1xPBSを150μlずつ加えボルテックスした
- ↓蛍光数値の測定をした
- (2) 電気泳動→ゲルの切り出し→ゲル抽出→ライゲーション→トランスフォーメーション
- 11日(14)(15)(16)と手順は同じである
- 変更点のみ以下に示す
- ゲル抽出後の濃度より
- X=ベクター(pSB1C3)の量
- Y=プロモーターの量 とし、
- ベクターの濃度(94ng/μL)xX : プロモーターの濃度xY = 1:2
- ベクターの長さ(2072) プロモーターの長さ
- よりライゲーションの濃度を決定した
表1: ライゲーションの試薬組成 AcrAB 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 1.9μL dps 0.9μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 1.9μL oxyR 0.8μL + pSB1C3 7.2μL + H2O 2.0μL ahpC 1.3μL + pSB1C3 6.5μL + H2O 2.2μL sufA 0.7μL + pSB1C3 7.0μL + H2O 2.3μL - これらに2xligation Bufferを10μL加え全量20μLとした
- (3) DH5αにトランスフォーメーションしたベクターのコロニーをピックアップ、ストリーク
- DH5αにトランスフォーメーションしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3の
- コロニーをピックアップしクロラムフェニコール入りLB寒天培地にストリークし3時間程37℃インキュベートした
- (4) (3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を液体培養
- (3)でストリークしたdps on pSB1C3、AcrAB on pSB1C3、yaiA on pSB1C3を白金耳でとり、
- クロラムフェニコール入り3mlLB液体培地に加え、37℃、一晩、インキュベートした
- (5) AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1の培養
- AhpC GFP onPSB6A1、Suf GFP onPSB6A1、SodA GFP onPSB6A1、yaiA GFP onPSB6A1
- プロモーターレス GFP onPSB6A1のストリークしてあるマスタープレートから白金耳でひっかいて、
- アンピシリン入りLB液体培地3mlに加えた
- ↓5時間程、37℃、振とう培養し冷蔵保存した
Results
- (1)
表2: 吸光度測定結果 1/20 yaiA SufA ahpC プロモーターレスpSB6A1 0.392 0.420 0.460 0.430 0.394 0.430 0.460 0.454 0.460 0.430 0.458 0.452
表3: 蛍光数値測定結果 yaiA H2O2濃度 1回目 2回目 3回目 1mM 0.1638 0.1632 0.1647 100μM 0.1459 0.1406 0.1422 10μM 0.1611 0.1652 0.1605 1μM 0.1727 0.1781 0.1789 100nM 0.1578 0.1635 0.1579 10nM 0.1739 0.1795 0.1751 1nM 0.1594 0.1625 0.1598 H2O2less 0.1695 0.1695 0.1675 SufA H2O2濃度 1回目 2回目 3回目 1mM 2.261 2.318 2.337 100μM 1.552 1.58 1.568 10μM 1.345 1.37 1.37 1μM 1.337 1.343 1.338 100nM 1.384 1.404 1.409 10nM 1.276 1.201 1.284 1nM 1.306 1.288 1.276 H2O2less 1.268 1.265 1.272 ahpC H2O2濃度 1回目 2回目 3回目 1mM 12.27 12.64 13.2 100μM 7.322 7.432 7.579 10μM 5.981 6.036 6.112 1μM 4.851 4.899 4.974 100nM 4.181 4.184 4.256 10nM 4.559 4.633 4.689 1nM 4.436 4.381 4.466 H2O2less 4.788 4.826 4.931 プロモーターレスpSB6A1 H2O2濃度 1回目 2回目 3回目 1mM 0.3694 0.3775 0.3734 100μM 0.4109 0.407 0.3898 10μM 0.2903 0.2949 0.2925 1μM 0.2692 0.2748 0.2714 100nM 0.3457 0.3414 0.3443 10nM 0.2785 0.2854 0.2838 1nM 0.3217 0.333 0.3311 H2O2less 0.2171 0.2207 0.2268
- (2)電気泳動結果: SodAのみUVの照射によるインサートの制限酵素処理の確認でインサートが見当たらなかった
- これはおそらく制限酵素処理がきちんとなされていなかったため
- ゲル抽出後の吸光度
AcrAB 1回目 0.024 2回目 0.017 3回目 0.005 4回目 0.017 5回目 0.005 Ave 0.0136 濃度 13.6ng/μL dps 1回目 0.018 2回目 0.016 3回目 0.017 4回目 0.017 5回目 0.017 Ave 0.015 濃度 16.6ng/μL oxyR 1回目 0.019 2回目 0.018 3回目 0.019 4回目 0.019 5回目 0.019 Ave 0.0188 濃度 18.8ng/μL ahpC 1回目 0.036 2回目 0.035 3回目 0.035 4回目 0.035 5回目 0.036 Ave 0.035 濃度 35.0ng/μL sufA 1回目 0.014 2回目 0.018 3回目 0.018 4回目 0.018 5回目 0.017 Ave 0.017 濃度 17.0ng/μL
- (3) コロニーをピックアップする時点で明らかにRFPが乗っているものがどのプレートにも現れていた
- 37℃インキュベート後の結果より、ストリークはうまくできていたがRFPで色づいたであろうコロニーを
- ピックアップしストリークしたものも赤く色づいてた。これは前回の制限酵素処理が不十分だったためと考えられる
- (4) (3)でストリークしたもので赤くないものを選び培養した
- 次回この培養させた
- AhpC GFP onPSB6A1,Suf GFP onPSB6A1,SodA GFP onPSB6A1,yaiA GFP onPSB6A1,プロモーターレス GFP onPSB6A1を集菌する
- (5) 次回、集菌作業を行う
September 20
Time
- 10:00~
Member
- 竹内、革島、中村
- Takeuchi,Kawashima,Nakamura
Purpose
- Cultivate of pSB1C3 and DNA miniprep of this and digestion by restriction enzymes.[Kawashima]
- GFP fluorescent strength measurement of ahpC and sufA.[Nakamura]
- (1) 提出用ベクターpSB1C3の培養→ミニプレ(カラム不使用)→制限酵素処理 [革島]
- (2) ahpC及びsufAのGFP蛍光強度測定 [中村]
Method
- (1) 提出用ベクターpSB1C3の培養→ミニプレ(カラム不使用)→制限酵素処理
- *培養
- 白金耳によるLB培地3mL(+クロラムフェニコール)へのpSB1C3の培養
- *ミニプレ
- 9/15カラム不使用のミニプレ参照
- 最後はRNase 20ng/μL入りMilliQ(50倍希釈) 30μLに溶かした
- *制限酵素処理
- EcoRⅠ、pstⅠを3μL用い、Total 50μLで処理した
- (2) ahpC及びsufAのGFP蛍光強度測定
- Overnightで培養したahpC及びsufA各2本のO.D.600を測定した
- ↓適正であったahpC1本とsufA2本をLB培地(+amp)でO.D.600が0.5になるように希釈した
- ↓O.D.600が0.4~0.6の間にあることを確認し、500μLずつエッペンに分注した(各5本)
- ↓終濃度が100nM、50nM、10nM、5nM、1nMとなるように過酸化水素を加えた
- ↓37℃、30minインキュベート
- ↓cfg. 4℃ 10,000rpm 1min
- ↓アスピレーターで上清を除いた
- ↓ペレットをPBS150μLに溶かし、内100μLを蛍光強度測定に用いた
*過酸化水素付加後の時間を20minで2回目を行った
Results
- (1)
- *培養
- 残り7本はアートに使用する
- *ミニプレ
表1: ミニプレ結果 pSB1C3 1 pSB1C3 2 OD260 0.581 0.592 DNA濃度 14525ng/μL 14800ng/μL 全量 31μL 33μL
- *制限酵素処理
- なし
- (2)
表2: ahpC、sufAの蛍光強度(1回目) ahpC 2 sufA 1 sufA 2 100nM 11.94 1.384 1.151 50nM 11.57 1.348 1.182 10nM 12.22 1.326 1.113 5nM 12.13 1.371 1.210 1nM 12.61 1.319 1.153 表3: ahpC、sufAの蛍光強度(2回目) ahpC 2 sufA 1 sufA 2 100nM 16.26 1.384 1.081 50nM 14.75 1.251 1.185 10nM 13.95 1.395 1.352 5nM 16.82 1.295 1.211 1nM 13.90 1.322 1.174
Consideration
- (1) 問題なく結果を出せた
- (2) ahpC、sufA共に前回の実験で見られた、10nM前後の濃度で蛍光強度が大きくなる傾向が見られた
- これはプロモータ自体の特性という可能性と実験操作のミスが主に考え得る
- しかしながら、以前の大腸菌の生存曲線作成時、
- 作ってから日数のたった過酸化水素の各濃度ストックは揮発性により実験結果に影響が出たという事例がある
- 次回以降は、過酸化水素ストックの濃度、及び実験操作に留意し、実験を行う予定である
September 21
Time
- 9:00~
Member
- 古道、竹内、臼井、革島、中村、吉村
- Furumichi,Takeuchi,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura
Purpose
- (1) PCR済AcrAB 1,2の吸光度測定→制限酵素処理 [革島]
- (2) AcrAB、dps、pSB1C3、RFP、yaiA 1,2のゲル抽 [革島]
- (3) ahpC、oxyR、sufAの蛍光強度測定 [中村]
- (4) promoterless CFP(E0420), promoterless YFP(E0430)のプラスミド抽出と制限酵素処理 [吉村]
- (5) dpsのPCRとPCR後の制限酵素処理 [古道]
- (6) DNA抽出後のAcrAB、dps、RFP、yaiA 1,2の濃縮 [古道、竹内]
Method
- (1) PCR済AcrAB 1,2の吸光度測定→制限酵素処理
- *吸光度測定
- 100倍希釈で測定した
- *制限酵素処理
- AcrAB 1 50μLに対してEcoRⅠ1μL、speⅠ0.5μLでTotal100μLになるよう処理した
- AcrAB 2 110μLに対してEcoRⅠ1μL、pstⅠ1μLでTotal1500μLになるよう処理した
- (2) AcrAB、dps、pSB1C3、RFP、yaiA 1,2のゲル抽
- 9月15日のカラム不使用と同様
- (3) ahpC、oxyR、sufAの蛍光強度測定
- ahpCに関しては、前日から振とう培養していたものと、今日21日に培養したものの2つを行った
- oxyR、sufAに関しては、今日培養したものを使って、実験を行った
- 実験操作は20日参照
- *前回、H2O2のストックに問題があるのではとの考えが生じた為、H2O2の各濃度ストックから作製した
- (4) promoterless CFP(E0420), promoterless YFP(E0430)のプラスミド抽出と制限酵素処理
- 各サンプルを培養した
- 培養条件: 3時間, 3mlのLB(ampicilin 終濃度50ul/ml)
- ↓Cfg.14,000 30sec で遠心した
- ↓Cfg.14,000rpm 30sec で遠心したのち、100ulのsolⅠを加えた
- ↓vortexにより懸濁したのちsolⅡを200ul加え、2分後にsolⅢを150ul加えた
- ↓Cfg.14,000rpm 10min で遠心したのち、上清を回収し、200ulのフェノール/CIAAを加えた
- ↓vortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5min で遠心した
- ↓上清を回収し、さらにCIAAを200ul加えvortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5minで遠心した
- ↓上清を回収し、500ulのイソプロパノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した
- ↓上清を取り除き200ulの70%エタノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した
- ↓上清を取り除いた後、サンプルを乾燥させ(TOMY micro vac MV-100 30sec)30ulのTE-RNaseに溶解させた
- 以上の操作において、solⅠ,solⅡ,solⅢは以下のものを用いた
- SolⅠ: 50mM グルコース, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA
- SolⅡ: 0.2N NaOH, 1%SDS
- SolⅢ: 5M CH3COOK,CH3COOH
- 制限酵素処理を行うために吸光度を測定した
- 吸光度より下表1の組成で制限酵素処理を行った
- ネガティブコントロール用に5μlだけDNAを残した
- これを37℃のインキュベーターに入れた(overnight)
表1: 制限酵素処理 DNA 23.8μl EcoRⅠ 0.3μl XbaⅠ 0.3μl M Buffer 5μl Milli Q 20.6μl Total 50μl
- (5) dpsのPCRとPCR後の制限酵素処理
- プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)をすでにMixしたプライマー(dps)を
- 各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた
- ↓それぞれのエッペンに下表2の組成で溶液を加えた
- ↓下表3のプログラムでPCR反応を行った
- ↓電気泳動にかけた
- ↓吸光度測定した(100倍希釈)
- ↓制限酵素処理を以下の条件で行った
- ↓37℃、一晩、インキュベート
表2: PCR試薬組成 テンプレートDNA(DH5α) 各 0.5μL 10xPCR Buffer for KOD-Plus- 5μL 2mM d NTPs 5μL 2mM MgSO4 4μL MilliQ 33μL KOD-Plus- 1μL 表3: dpsのPCR反応 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 30sec 2min 保持 35サイクル 表4: dps 1(284µg/ml) DNA(dps) 40μl Buffer H 5μl H2O 2.378μl EcoRⅠ 1.135µl PstⅠ 1.262µl total 50µl 表5: dps 2(319μg/ml) DNA(dps) 40μl Buffer H 5µl H2O 2.307μl EcoRⅠ 1.276μl total 50µl
- (6) DNA抽出後のAcrAB、dps、RFP、yaiA 1,2の濃縮
- DNA抽出後のAcrAB、dps、RFP、yaiA 1,2にDNAの5倍量の100%エタノールを加えた
- ↓DNAの1/5倍量のCH3COONaを加えた
- ↓4℃、14,000rpm、20min遠心
- ↓上澄みを除き70%エタノールを200µl加えた
- ↓4℃、14,000rpm、10min遠心
- ↓上澄みを除き30µlのRNase入りのTEを加えた
- (本来ならこの手順の前に乾燥が必要なのだがここでは行わなかった)
- ↓吸光度測定をした
Results
- (1)
表5: 吸光度測定 1/100 AcrAB 1 AcrAB 2 OD260 0.138 0.357 DNA濃度(ng/μL) 690 1875 全量(μL) 40 110 - (2) 吸光度は誤差の範囲でしか得られなかったため、(6)で濃縮を行った
- (3)
表6: ahpCの蛍光強度測定 1nM 5nM 10nM 50nM 100nM ahpC 1 11.57 11.59 10.82 10.18 5.896 ahpC 2 11.25 11.68 10.94 11.36 8.862 表7 ahpC、oxyR、sufAの蛍光強度測定 1nM 5nM 10nM 50nM 100nM 1μM ahpC 13.55 1.344 13.75 15.34 15.21 12.69 oxyR 6.940 6.185 6.044 6.519 6.046 5.571 sufA 0.2307 0.2296 0.2455 0.2546 0.1985 0.2269
- (4)
表8: 吸光度測定結果 1/500 CFP YFP 1回目 0.148 0.174 2回目 0.147 0.174 3回目 0.143 0.164 4回目 0.147 0.166 5回目 0.143 0.163 平均 0.1456 0.1682 DNA濃度 3460ng/μl 4205ng/μl
- (5) 電気泳動の結果、綺麗にバンドが検出され十分なPCR処理が認められた
表9: 吸光度測定結果 1/100 dps 1 dps 2 1回目 0.059 0.069 2回目 0.058 0.067 3回目 0.057 0.065 4回目 0.058 0.059 5回目 0.052 0.059 平均 00568 0.0638 DNA濃度 284μg/ml 319μg/ml
- (6)
表10: 吸光度測定結果 AcrAB dps RFP yaiA 1 yaiA 2 濃度 37.6ng/μl 14.4 ng/μl 17.6ng/μl 19.8ng/μl 13.0ng/μl
Consideration
- (2) 切り取ったバンドが太すぎたことが原因であったと考えられる
- (3) 今回H2O2を新しく調整して実験を行ったが、前日同様 、濃度に比例した蛍光強度は得られなかった
- しかし、これは1nM∼100nM付近での現象であり、
- 全体を通しての傾向ではないので、ペンの機能的には問題ないかと思われる
- また、sufAの蛍光強度の結果に関しては、きわめて低い値が出てしまったのは、
- おそらく実験操作中に何かしらの操作ミスが考えられる
- (4) DNA濃度が十分であることからプラスミド抽出に成功したと言える
- (5) 制限酵素処理したPCR済dpsは次回以降にゲル抽出する
- (6) 吸光度測定の結果より、十分な濃度のDNAが取れた
September 22
Time
- 9:00~
Member
- 福山、竹内、臼井、革島、中村、吉村
- Fukuyama,Takeuchi,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura
Purpose
- (1) ahpC、sufAのGFP蛍光強度測定 [中村]
- (2) ahpC、dps、CFP、YFP、pSB1C3、RFP のゲル抽 [革島、吉村]
- (3) ahpC,sufAのPCR [臼井]
- (4) pSB1C3のアルカリミニプレップ [臼井]
Method
- (1) ahpC、sufAのGFP蛍光強度測定
- 22日朝から3h、37℃で振とう培養したものの内、各1本ずつを実験に用いた
- また、今回は過酸化水素濃度を終濃度、
- 1mM、100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nMおよび過酸化水素を加えないH2O2lessの8種類で比較実験を行った
- *実験操作は20日参照
- (2) ahpC、dps、CFP、YFP、pSB1C3、RFP のゲル抽
- 下表1の組成でゲルにアプライした
- ↓50Vで30分間電気泳動した
- ↓UVを照射してゲルを切り出した
- ↓切り出し後
- ↓(井沢先生流)
- ↓H2O 400μL
- ↓65℃ 40min
- ↓ほとんど溶けなかったのでゲルを取り出し溶けた分でゲル抽を進めた
- ↓Phe等量 voltex
- ↓ cfg. 14,500rpm 5min 25℃
- ↓上清を新チューブへ
- ↓Phe/Chl等量 voltex
- ↓ cfg. 14,500rpm 5min 25℃
- ↓上清を新チューブへ
- ↓3M CH3COONa 50μL、イソプロ 800μL
- ↓ cfg. 14,500rpm 10min 4℃
- ↓上清除き、70%EtOH 150μL
- ↓ cfg. 14500rpm 5min 4℃
- ↓ 乾燥機 5min
- ↓MilliQ 10μL
表1: 試薬組成 ahpC、dps、pSB1C3、RFP DNA 50μl Loading Buffer 10μl CFP、YFP DNA 45μl Loading Buffer 9μl
- (3) ahpC,sufAのPCR
- 9月15日とまったく同じ試薬の組成、温度設定でsufA,ahpCについて各4本ずつPCRを行った
- →これらのうち二本は制限酵素処理(片方はE-Sで処理、もう片方はE-Pで処理)を行い、後の二本は保存した
表2: 試薬組成 DNA(sufA,ahpC) 24μL 10xH-Buffer 4μL H2O 10.5μL(10μL) EcoRⅠ 1μL SpeⅠ(PstⅠ) 0.5μL(1μL) 全量 40μL
- (4) pSB1C3のアルカリミニプレップ
- 菌液を1.5mLエッペンにデカンテーションで移した
- ↓cfg.4℃ 6,000rpm 2min
- ↓上清を捨て、SolutionⅠ 100μLを加えて、上下に反転させた
- ↓常温で5min放置
- ↓SolutionⅡ 200μLを加えて上下に反転
- ↓on ice 5min
- ↓SolutionⅢ 150μLを加えて、vortex
- ↓on ice 5min
- ↓cfg.4℃ 15,000rpm,5min
- ↓上清を1.5mLエッペンにとり、ΦOH/CIAA 200μLを加えてvortex
- ↓cfg.4℃ 1,5000rpm,5min
- ↓上部の水層を1.5mLエッペンに移し、100%EtOH 1mLを加え、上下に反転した
- ↓常温10min放置
- ↓cfg.4℃ 15,000rpm,12min
- ↓70%EtOH 500μL
- ↓cfg.4℃,15000rpm,3min
- ↓EtOHをアスピレーターで取り除き、2min遠心乾燥した
- ↓TE30μLを加え溶解した
- ↓吸光度を測定し、制限酵素処理を行った
表3: 制限酵素処理試薬組成 pSB1C3のDNA 26μL 10xH-Buffer 4μL EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL H2O 9μL 全量 40μL
Results
- (1)
表4: ahpC、sufAのGFP蛍光強度 H2O2less 1nM 10nM 100nM 1μM 10μM 100μM 1mM ahpC 14.49 14.32 14.34 14.24 15.01 19.26 19.19 22.92 sufA 3.972 3.772 3.913 3.862 3.883 3.844 4.097 4.711 - *測定は3回行い、その平均を取った
- *添付ファイルにグラフ添付
- (2) 電気泳動の結果、全体的にバンドの判別が難しく、RFPとdpsは切り出せなかった
- また、マーカーが十分に展開されていなかった
表5: DNA濃度 CFP pSB1C3 OD260 0.016 0.012 DNA濃度 60 80 全量 9 9 - 1%アガロースゲルは30MilliQには溶けなかったので溶出した分で井沢先生流ゲル抽出を行った
- がしかし、やはりバンドの部分が溶けておらず結果は良くなかった
- YFP、ahpCは吸光度マイナスが出たので破棄した
- (3) PCR産物の吸光度を測る時間がなかったので次の日に測定していると思います
- (4)
表6: ミニプレ後の吸光度 pSB1C3: 100倍希釈 一回目 0.581 二回目 0.567 三回目 0.559 四回目 0.561 五回目 0.559 Ave 0.565 濃度 2825ng/μL
Consideration
- (1) 前回同様、低濃度域において、蛍光強度が過酸化水素濃度に比例しない値をとったが、
- 全体を通してはahpC、sufAともにおおよそ、濃度に比例する値が得られた
- (2) 結果より、電気泳動の時間が短すぎたと思われる
- 井沢先生流でゲル抽を行う場合、MilliQに溶ける1%低融点ゲルを使用する必要がある
- (4) 濃度がミニプレの割に低いのはおそらくミニプレ事態のミスではなく
- pSB1C3の菌液事態が濃度が薄かったためだと考えられる
September 23
Time
- 9:00~
Member
- 竹内、臼井、革島、中村、吉村
- Takeuchi,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura
Purpose
- (1) sufA pSB1C3の液体培養 [革島]
- (2) ahpC pSB1C3のシングルコロニーピックアップ [革島]
- (3) sufA(pSB1C3)のプラスミド抽出と制限酵素処理 [革島]
- (4) RFP(promoterless)のミニプレ→制限酵素処理 [中村]
- (5) dpsのPCR [中村]
- (6) ahpCのPCR [臼井]
- (7) oxyR,SodA,sufA,yaiA,AcrAB,ahpCの濃度測定と制限酵素処理 [臼井]
Method
- (1) sufA pSB1C3の液体培養
- LB(amp-)4ml、クロラムフェニコール(50ng/μL)4μL加えた試験管4本に植菌
- (2) ahpC pSB1C3のシングルコロニーピックアップ
- LBプレート(クロラムフェニコール+)1枚(6分割)に植菌
- (3) sufA(pSB1C3)のプラスミド抽出と制限酵素処理
- 平常通りプラスミド抽出を行った
- 手順は9月21日と同じ
- ↓吸光度を測定し、下表1の組成で制限酵素処理を行った
- ↓37℃のインキュベーターの中に入れた(overnight)
表1: 制限酵素処理1 DNA 28.8μl EcoRⅠ 0.3μl SpeⅠ 0.16μl H Buffer 5μl Milli Q 15.74μl Total 50μl
- (4) RFP(promoterless)のミニプレ→制限酵素処理
- RFP(promoterless)をLB培地(l)3mLに2本分培養した
- ↓これをアルカリミニプレップし、TE(RNase入)30μLに溶かした
- ↓DNA濃度のより大きいほうをDNAsol 3μLでE-X制限酵素処理を行った(Overnight)
表2: 制限酵素処理2 DNAsol 3μL EcoRⅠ 1μL XbaⅠ 1μL 10xM 5μL H2O 40μL Final 50μLx4本
- (5) dpsのPCR
- 下表3の試薬組成で、下表4のプログラムに従って行った
表3:試薬組成 dpsM 0.75μL Buffer 2.5μL dNTPs 2.5μL KOD-Plus 1μL H2O 16.5μL Final 25μL 表4: PCRプログラム 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60.2℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 30sec 30sec 30sec 2min 保持 35サイクル
- (6) ahpCのPCR
- 9月15日とまったく同じプログラム、試薬組成で4本ずつPCRを行った
- (7) oxyR,SodA,sufA,yaiA,AcrAB,ahpCの濃度測定と制限酵素処理
- oxyR,SodA,sufA,yaiA,AcrAB,ahpCの吸光度を測定し、E-SまたはE-Pで制限酵素処理を行った
- 試薬組成は9月22日と同様
Results
- (1) 生育した
- (2) 翌日生えていた
- (3)
表5: 吸光度測定結果 1/500 1回目 0.498 2回目 0.506 3回目 0.512 4回目 0.504 5回目 0.503 平均 0.5046
- (4)
表6: DNA濃度 DNA濃度 全量 RFP1 9,189ng/μL 29μL RFP2 12,060ng/μL 17μL
- (5) 明日、吸光度測定および制限酵素処理予定
- (6) →(7)で使用
- (7) それぞれ1はE-Sで制限酵素処理、2はE-Pで制限酵素処理するもの
- yaiAはE-Pで処理、ahpCはE-Sで処理
表7: 濃度測定結果 oxyR 1 oxyR 2 SodA 1 SodA 2 sufA 1 sufA 2 yaiA AcrAB 1 AcrAB 2 ahpC 1 0.072 0.082 0.059 0.066 0.066 0.057 0.078 0.075 0.067 0.071 2 0.075 0.084 0.071 0.060 0.077 0.056 0.083 0.096 0.097 0.071 3 0.076 0.093 0.068 0.059 0.071 0.062 0.081 0.075 0.071 0.066 4 0.077 0.095 0.065 0.060 0.074 0.061 0.080 0.090 0.072 0.067 5 0.073 0.078 0.065 0.063 0.070 0.060 0.079 0.073 0.070 0.067 Ave 0.0746 0.0864 0.0656 0.0616 0.0716 0.0592 0.0802 0.0818 0.0694 0.0672 濃度ng/μL 373 432 328 308 358 292 401 409 347 336
- ※制限酵素処理に関して、
- SpeⅠが途中でなくなってしまい、AcrABを除くE-Sでの処理が行えなかった
- またこのときすでにEcoRⅠは加えてしまった後だったので、翌日(25日)にフェノクロ処理を行い、
- PCR産物をEcoRⅠだけで切れた状態にし、SpeⅠが届き次第制限酵素処理を行える状態にした
Consideration
- (3) 吸光度測定結果より、DNA濃度が十分であることからプラスミド抽出に成功したといえる
September 24
Time
- 9:00~
Member
- 福山、竹内、臼井、中村、吉村
- Fukuyama,Takeuchi,Usui,Nakamura,Yoshimura
Purpose
- (1) pSB1C3(BBa_J04450),pSB6A1(BBa_I13507)のゲル抽出 [福山、竹内]
- (2) DH5α pSB6A1(SufA,GFP),pSB6A1(ahpc,GFP)の液体培地での培養 [福山]
- (3) Amp入りのプレート培地にはえている
- DH5α pSB6A1(promoter less,YFP)
- pSB6A1(promoter less,CFP)
- pSB6A1(SodA,GFP)
- pSB6A1(SufA,GFP)
- pSB6A1(dps,GFP)
- pSB6A1(OxyR,GFP)
- pSB6A1(AcrAB,GFP)
- pSB6A1(ahpc,GFP) の、新しいAmp入りプレート培地へのうえつぎ [福山]
- (4) 前日にPCRしたdpsの吸光度測定 [福山]
- (5) 制限酵素処理を終えたpSB1C3(SufA)のカットチェック [福山]
- (6) acrAB、oxyR、sodA、sufA、yaiA、pSB1C3のゲル抽出 [中村]
- (7) 前日にEcoRⅠでしか切ることのできなかったahpC,oxyR,SodA,sufAのフェノクロ処理 [臼井]
Method
- (1) pSB1C3(BBa_J04450),pSB6A1(BBa_I13507)のゲル抽出
- 制限酵素処理を終えたpSB1C3(BBa_J04450)とpSB6A1(BBa_I13507)を
- 50μlにつき3μlずつCIAPを加えて37℃でインキュベート
- ↓低融点ゲルを用いたゲル抽出を行った
- (2) DH5α pSB6A1(SufA,GFP),pSB6A1(ahpc,GFP)の液体培地での培養
- Amp入りのLBプレート培地にはえているDH5α(pSB6A1(SufA,GFP)とpSB6A1(ahpc,GFP))を
- Amp入りLB液体培地で、37℃で6時間ほど振とう培養した
- ↓冷蔵庫に保管した
- (3) Amp入りのプレート培地にはえているDH5αのうえつぎ
- pSB6A1(promoter less,YFP)
- pSB6A1(promoter less,CFP)
- pSB6A1(SodA,GFP)
- pSB6A1(SufA,GFP)
- pSB6A1(dps,GFP)
- pSB6A1(OxyR,GFP)
- pSB6A1(AcrAB,GFP)
- pSB6A1(ahpc,GFP)
- を、新しいAmp入りプレート培地へそれぞれストリークし、37℃でインキュベートした
- (4) 前日にPCRしたdpsの吸光度測定
- 前日にPCRしたdpsの吸光度測定を100倍希釈したDNA溶液を用いて行った
- (5) 制限酵素処理を終えたpSB1C3(SufA)のカットチェック
- 1kbp DNA ladder,制限酵素処理を終えたpSB1C3(SufA),アルカリミニプレップを終えたpSB1C3(SufA),PCR後のSufAを
- 2%アガロースゲルで135V15分間電気動した
- ↓EtBr入り染色液で15分間染色した
- ↓UVをあてて写真撮影し、バンドの大きさと数を確認した
- (6) acrAB、oxyR、sodA、sufA、yaiA、pSB1C3のゲル抽出
- E-Pカットで制限酵素処理した各プロモーターとベクター(pSB1C3)を青ゲルを用いて抽出した
- プロモーター溶液(24μL)に対し5μL、ベクター溶液(49μL)に対し9μLのOrange Bufferを加えた
- ↓1%低融点アガロースの青ゲルで、100V、25min電気泳動した
- ↓各バンドを切り出した
- ↓水400μLを加え、60℃のヒートブロックで溶解させた(vortex)
- ↓等量のフェノールを加えた
- ↓ cfg. 25℃ 13,000rpm 5min
- ↓新しいエッペンに上清を回収した
- ↓ΦOH/CIAAをエッペンの8割程度(約800μL)まで加え、vortexにより混合した
- ↓ cfg. 25℃ 13,000rpm 5min
- ↓新しいエッペンに上清を回収した
- ↓CH3COONa50μL、イソプロパノール800μLをそれぞれ加えた
- ↓ cfg. 4℃ 14,500rpm 10min
- ↓上清を捨てた
- ↓70%EtOH500μLを加えた
- ↓ cfg. 4℃ 14,50rpm 5min
- ↓EtOHを捨てた
- ↓2min 遠心乾燥し、1xTE(RNase入)30μLに溶解した
- ↓冷蔵保存
- (7) 前日にEcoRⅠでしか切ることのできなかったahpC,oxyR,SodA,sufAのフェノクロ処理
- 前日にSpeⅠのストックがなくEcoRⅠだけで切った状態のahpC,oxyR,SodA,sufAの4種類のプロモーターに関して、
- フェノクロ処理を行い、制限酵素およびその試薬を取り除いた
- ΦOH/CIAA 200μLを加えた
- ↓cfg.4℃ 15,000rpm,5min
- ↓上部の水層を回収し、100%EtOH 1mLを加えた
- ↓室温 10min
- ↓cfg.4℃ 15,000rpm,12min
- ↓上清を捨て、70%EtOH 500μLを加えた
- ↓cfg.4℃ 15,000rpm,3min
- ↓EtOHを取り除き、遠心乾燥2min
- ↓H2O 30μLに溶解
Results
- (1) 十分なバンドを確認することができなかったため、DNAを得ることができなかった
- (2) 培養できていた。これは予備で培養したものなので以後使わない可能性もある
- (3) 培養できていたのかどうかはまだ今日は確認できていない。明日の朝すぐに確認できると思われる
- (4) 測定結果を下表1に示した
表1: 吸光度測定結果 1/100 dps 1 dps 2 1回目 0.06 0.085 2回目 0.054 0.084 3回目 0.051 0.091 4回目 0.051 0.086 5回目<?TD> 0.05 0.086 平均 0.0532 0.0864 - 表から求めたdps 1の濃度:266ng/μl
- 表から求めたdps 2の濃度:432ng/μl
- (5) 制限酵素処理後→1kb と2kbのバンドが一本ずつ確認できた
- 制限酵素処理前→3kbのバンドが確認できた
- SufAのみ→1kbのバンドが見られた
- 以上の結果より、制限酵素処理は成功していると考えた。→明日以降にゲル抽出
- また、制限酵素処理前のアルカリミニプレップを終えた試料では、
- DH5αのゲノムDNAのバンドがpSB1C3(SufA)のバンドと同じくらいはっきり出ていた
- (6) 各プロモーターに関しては、バンドが確認できた(oxyRなど薄いバンドもあった)
- しかし、pSB1C3に関しては、バンドが見えず、切り出しができなかった
- 今回得られた、各プロモーターDNAについては、後日ライゲーション予定
- (7)
表2: 吸光度(1/100) sufA SodA ahpC oxyR 1 0.040 0.041 0.028 0.018 2 0.039 0.023 0.033 0.025 3 0.035 0.027 0.027 0.020 4 - 0.043 - - 5 - 0.031 - - Ave 0.038 0.033 0.0293 0.021 濃度ng/μL 190 165 147 105
Consideration
- (1) 泳動時間が十分でなかったことが主な原因であると考えられる
- 次回からはこまめにバンドの移動を確認して泳動時間を調節するべきである
- (5) アルカリミニプレップの操作の過程で、大腸菌のゲノムDNAは除かれると期待していたが
- 電気泳動の結果からいって、ゲノムDNAは十分に除去されているとはいえない
- これでは、吸光度の値から求めるプラスミドの濃度は正確にでていない可能性がある
- (6) 今後は、青ゲルでバンドが見えない場合は、念のためUV下で確認すること
- (7) フェノクロ処理後の濃度はPCR後の濃度よりも下がってしまう
September 25
Time
- 9:00~
Member
- 福山、臼井、中村、吉村
- Fukuyama,Ysui,Nakamura,Yoshimura
Purpose
- (1) 提出用pSB1C3のプラスミド抽出 [吉村]
- (2) DH5α(pSB1C3(BBa_J04450))の培養 [福山]
- (3) DH5α(pSB6A1:promoter less,RFP)のAmp入りLB液体培地での培養 [福山]
- (4) pSB6A1(ahpc,GFP),pSB6A1(SufA,GFP)のゲル抽出 [福山]
- (5) ahpC,sufA,TetR,K121013の蛍光強度測定 [臼井、中村]
Method
- (1) 提出用pSB1C3のプラスミド抽出
- 各サンプルを培養した
- 培養条件: 3時間, 3mlのLB(ampicilin 終濃度50ul/ml)
- ↓Cfg.14,000 30sec で遠心した
- ↓Cfg.14,000rpm 30sec で遠心したのち、100ulのsolⅠを加えた
- ↓vortexにより懸濁したのちsolⅡを200ul加え、2分後にsolⅢを150ul加えた
- ↓Cfg.14,000rpm 10min で遠心したのち、上清を回収し、200ulのフェノール/CIAAを加えた
- ↓vortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5min で遠心した
- ↓上清を回収し、さらにCIAAを200ul加えvortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5minで遠心した
- ↓上清を回収し、500ulのイソプロパノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した
- ↓上清を取り除き200ulの70%エタノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した
- ↓上清を取り除いた後、サンプルを乾燥させ(TOMY micro vac MV-100 30sec)30ulのTE-RNaseに溶解させた
- 以上の操作において、solⅠ,solⅡ,solⅢは以下のものを用いた
- SolⅠ: 50mM グルコース, 25mM Tris-HCl,, 10mM EDTA
- SolⅡ: 0.2N NaOH, 1%SDS
- SolⅢ: 5M CH3COOK,CH3COOH
- (2) DH5α(pSB1C3(BBa_J04450))の培養
- 9月16日からLB寒天培地に培養して保管していたDH5α(pSB1C3(BBa_J04450))を
- 白金耳でつついて、その先を3 mlのLB液体培地につけてゆらした
- ↓同じ操作を8回繰り返して8試料つくった
- ↓また、100mlのLB液体培地にも同様の操作をおこなった
- ↓37℃、overnightで振とう培養した
- (3) DH5α(pSB6A1:promoter less,RFP)のAmp入りLB液体培地での培養
- LB寒天培地に培養して保管していたDH5α(pSB6A1:promoter less,RFP)を
- 白金じでつついて、その先を3 mlのLB液体培地につけてゆらした
- ↓同じ操作を10回繰り返して10試料つくった
- ↓37℃、overnightで振とう培養した
- (4) pSB6A1(ahpc,GFP),pSB6A1(SufA,GFP)のゲル抽出
- 1%アガロースゲルを用いて、EcoRⅠとSpeⅠで切断されたpSB6A1(ahpc,GFP)、pSB6A1(SufA,GFP)を100Vで25分間電気泳動した
- 確認のため、同時に各試料2~3 μlずつとって1%アガロースゲルを使って135Vで15分間電気泳動した
- ↓確認のための電気泳動でバンドを確認
- ↓UVを照射してバンドを確認できたので、ゲルを切り出した
- ↓各バンドの試料につき400 μlずつMilliQを加えた
- ↓フェノールを430 μlほど加えた
- ↓遠心(13000 rpm、5分間、25℃)
- ↓上清を回収
- ↓フェノールクロロフォルムを加えるはずが、間違えてイソプロパノールを加えてしまった
- (5) ahpC,sufA,TetR,K121013の蛍光強度測定
- 菌液濁度(O.D.600)を0.4~0.6に調整した
- ↓終濃度がlessおよび1nM~1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した
- ↓37℃でインキュベートし、10分ごとに菌液500μLずつ回収した
- ↓cfg.4℃,14000rpm,1min
- ↓上清を除いた
- ↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した
- ↓全量を蛍光強度測定に用いた
- ※この操作を80分まで行った
Results
- (1) 電気泳動の結果、インサート+ベクターの長さが3141bpなのに、2100bpのところにバンドが出ていた
- 吸光度を測定し、DNA濃度を測定したところ、4825ng/μl(全量150μl)だった
- (2) 今日の時点ではまだ培養できているのかわからない
- (3) 今日の時点ではまだ培養できているのかわからない
- (4) イソプロパノールを加えた時点で、どうすればいいのかわからず、結局どちらの試料とも廃棄した
- (5) 結果は29日の実験ノートにExcelファイルで添付
Consideration
- (1) プラスミドを環状のままにして電気泳動してしまったため、予想された場所にバンドがでなかったと思われる
- (5) 菌液の量が少なかったため、80分しか測定ができなかったので以後の実験では菌液量を増やし改善