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Template:KIT-Kyoto-Augsut29
From 2010.igem.org
August 29
Time
- 9:00～
Member
- 岩城,古道,竹内,中村,臼井
- Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura,Usui
Purpose
- DNA miniprep , agarose gel electrophoresis and density measurement of pSB6A1(K121013).[Furumichi]
- PCR of hemH,ahpC,dps and OxyR.[Furumichi]
- Confirm SufA and OxyR by agarose gel electrophoresis.[Iwaki]
- DNA miniprep of pSB6A1(K121013).[Takeuchi]
- (1) pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定 [古道]
- (2) hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR [古道]
- (3) SufA,OxyRのPCRの電気泳動による確認 [岩城]
- (4) pSB6A1(K121013)のmidiprep [竹内]
Method
- (1) pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定
- 前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに8割ほど移した
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌した
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
- ↓上清をカラムに加えた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心を行った
- ↓溶出液を回収
- ↓電気泳動を行い、同時に260nmの波長で吸光度測定を行った
- (2) hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR
- プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を
- Mixしたプライマー(hemH,ahpC,dps,OxyR)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた
- ↓それぞれのエッペンに下に示した組成で溶液を加えた
- ↓下に示したプログラムでPCR反応を行った
- ↓PCR産物を電気泳動にかけた
テンプレートDNA 各0.5μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus- 5μL 2mM d NTPs 5μL 2mM MgSO4 4μL MilliQ 33μL KOD-Plus- 1μL
(ahpC,OxyR) 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 62.2℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min 保持 30サイクル (hemH,dps) 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 33sec 2min 保持 30サイクル - (3) SufA,OxyRのPCRの電気泳動による確認
- PCR産物5μlを使用して電気泳動を行った
- 1%ゲルを用いて135V,15minの条件で泳動した
- (4) pSB6A1(K121013)のmidiprep
- カラム2本に各EQ1 10ml加え平衡化した
- 前日から培養していたpSB6A1(K121013)100ml
- ↓R3を4 ml加えてボルテックスした
- ↓L7を4 ml加えて5 min放置した
- ↓N3を4 ml加えた
- ↓12,000rpm,10 min,25℃で遠心した
- ↓上清を保存しそれをカラムの上に全量載せた
- ↓カラムにW8を10 ml×2加え洗浄した
- ↓カラムにE4を5 ml加えた
- ↓チューブに2-プロパノールを3.5 ml加えた
- ↓15,000rpm,30min,4℃で遠心した
- ↓70 %エタノールを3 ml加えた
- ↓15,000rpm,30 min,4 ℃で遠心した
- ↓上清を捨て、37 ℃でインキュベート、乾燥させた
- ↓TE50 μlに溶かし、溶け切るまで冷蔵した
Results
- (1)
吸光度測定結果 0.059 0.055 0.062 0.059 0.070 平均 0.061
- この値から計算して、
- DNA濃度：0.061×100×50＝3.05×10²(μg/ml)
- 電気泳動の結果、きちんとバンドが検出された
- (2) PCR産物の電気泳動の結果、増幅に成功した
- (3) SufAに関しては全てのサンプルでバンドが検出できた
- OxyRに関しては1,2のサンプルはバンドが検出できたが、3,4では検出できなかったので破棄した
- (4) 冷蔵庫で保管した
