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Contents 1 October 3 2 October 4 3 October 5 4 October 6 5 October 7 6 October 8 7 October 9

October 3

Time

11:00~18:30

Member

岩城、福山、竹内、臼井、革島、吉村

Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Kawashima,Yoshimura

Purpose

(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション　[福山、革島]

(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)　[岩城]

(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養　[吉村]

(4)　ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR　[革島、吉村]

Method

(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション

＊ライゲーション

　pSB1C3 + SufA

　　　 　+ SufA+GFP

　　　　+ AhpC+GFP　　　　をそれぞれTotal20μLで3セットずつ調整

　↓16℃30min

＊トランスフォーメーション

　コンピテントセル100μLずつ加えた

　↓氷上30min

　↓42℃45min

　↓氷上2min

　↓SOC培地900μL加えた

　↓1h振とう培養

　↓ストリーク

(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)

　10/1にPCRをかけた続き(10/2の朝にPCRからだして冷凍保存しておいた)

　0.5 mlチューブに入っていたサンプルを1.5 ml チューブに移した

　↓3 M CH3COONaを1.5 μl加えた

　↓氷冷 15min.

　↓2-propanol 31.5 µl とMilli Q 7 µlを加えた

　↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)

　↓上清を捨てた

　↓70 % EtOHを50 µlを加えた

　↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)

　↓Remove sup.

　↓遠心乾燥した(良く乾かすこと)

　↓Hi-Di formamide 15 µlに溶かした

　↓95 ℃,2 min加熱した

　↓氷冷(急冷)

　↓0.5 mlチューブのふたを切ってサンプルを移した

　↓シークエンス用のゴムのふたをした

　↓シークエンサーにいれた

(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養

　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3を試験管で振とう培養した

(4)　ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR

　以下の組成とプログラムでPCRをahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,SacrAB,dpsの各プロモーターについて2本ずつおこなった

＊ahpC,sufA,oxyR,sodA プライマー(PM) 0.75ul テンプレートDNA 0.5ul MgSO4 2ul dNTPs 2.5ul KODplus 0.5ul Buffer 2.5ul Milli Q 16.25ul Total 25ul

表2: PCR設定 Pre Denature Denature Annealing Extention +Extention 94℃ 94℃ 61℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min ∞ 35サイクル

＊PCR産物の確認

　各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした

　↓1%アガロースゲルに＊と１kbpマーカー3μLを添加した

　↓135v,20minで電気泳動

　↓20minEtBr染色

　↓UV照射下でバンドの確認

Results

(1)　翌日24時間後までSufA以外コロニーが見られなかった

(2)　明日、シークエンスを確認

(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP)は培養に成功しているものもあったがpSB1C3に関しては翌日になるまで結果がわからない

(4)　吸光度を測定し濃度を計算した結果、

ahpC…1482ng/μl

　　2…360ng/μl

sufA1…265ng/μl

　　2…425ng/μl

oxyR1…367ng/μl

　　2…369ng/μl

sodA1…427ng/μl

　　2…340ng/μl

yaiA1…267ng/μl

　　2…481ng/μl

acrAB1…368ng/μl

　　2…557ng/μl

dps1…530ng/μl

　　2…440ng/μl

だった(全量は全て19μl)

＊電気泳動

　全てのバンドが正確な位置にはっきりと見られた

October 4

Time

19：00~22:30

Member

福山、竹内

Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1)　10月3日の実験(3)の結果の確認　[福山]

(2)　pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理　[福山]

(3)　SufA,ahpC,の制限酵素処理　[福山]

(4)　提出用ベクターpsB1C3のカットチェック　[福山]

Method

(1)　10月3日の実験(3)の結果の確認

　クロラムフェニコール入りのLB寒天培地にコロニーが見られるかどうかを確認した

(2)　pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理

　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓4試料を合わせたので溶出液の全量が400 μlほどになった

　↓このうち5μlとって20倍希釈して吸光度を測定した(*1)

　　また、1kb ladderとともに、各試料を表1のように調整して電気泳動し、EtBrで10分間ほど染色した(*2)

　↓酢酸ナトリウム100 μlと2-プロパノールを800 μl加えた

　↓軽く振ってまぜ、4℃、14,500rpmで10分間遠心した

　↓上清を回収した

　↓70 %エタノールを800 μl加えた

　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した

　↓上清を除いた

　↓乾燥した

　↓30μlのTEに溶かした。このうち1 μlをとって100倍希釈し、吸光度を測定した(*3)

　↓(*2)にUVをあて、写真撮影をした

　↓写真でバンドを確認した後、表2のように調整して制限酵素処理をovernightで行った

表1: 制限酵素処理1 単位はμl 試料1 試料2 試料3 試料4 DNA溶液 12.5 13 13 13 Buffer H 1.5 1.5 1.5 EcoRⅠ 0.5 0.5 PstⅠ 0.5 0.5 全量 15 15 15 13

表2: 制限酵素処理2 試料(μl) DNA溶液 29 Buffer H 4 EcoRⅠ 1 PstⅠ 1 Milli Q 5 全量 40

(3)　SufA,ahpC,の制限酵素処理

　表3、表4の通りに調整して(それぞれ2試料ずつ)、制限酵素処理をovernightで行った

表3: sufA(total 25 μl) DNAsol 20 μl EcoRⅠ 0.5 μl SpeⅠ 0.5 μl M buffer 2.5μl H2O 1.5 μl

表4: ahpC(total 25 μl) DNAsol 20 μl EcoRⅠ 0.5 μl SpeⅠ 0.5 μl M buffer 2.5 μl H2O 1.5 μl

(4)　提出用ベクターpsB1C3のカットチェック

　ミニプレ後のpSB1C3の試料を以下のように制限処理した

　そして、制限酵素処理した2つの試料と

　制限酵素処理をしなかった試料の合わせて3つの試料を以下の様に電気泳動し、バンドを確認した

　↓135V ,20分で電気泳動

　↓EtBr で20分間染色

　　バンドを確認した

pSB1C3(total 25 μl) DNAsol 20 μl EcoRⅠ 1 μl SpeⅠ 1 μl M buffer 2.5 μl H2O 0.5μl

pSB1C3(total 25 μl) DNAsol 20 μl SpeⅠ 1 μl M buffer 2.5 μl H2O 1.5μl

Results

(1)　DH5α(pSB1C3(SufA))の3つのプレートのうちの一つだけでコロニーの形成が見られた。

あとのDH5α(pSB1C3(ahpC))やDH5α(pSB1C3(SufA,GFP))はコロニーが確認できなかった

(2) (*1)の結果：20倍希釈の吸光度の平均は0.17であったので、濃度：170 ng/μl

(*2)の写真では、ベクター,インサート,の大きさは間違いないようであった。

(*3)の結果から求めた濃度：1148 ng/μl　← 6.8倍濃縮

(3)　明日にインサートとベクターの全量を電気泳動し、

フェノールクロロフォルム処理、ライゲーション、トランスフォーメーションを行う

(4)　EcoRⅠ, SpeⅠで制限酵素処理した試料は1kbp付近で予想に反したバンドを確認した

他の2試料は予想通りであった

Consideration

(4)　クロラムフェニコールが十分でなかったため、他の大腸菌が増えた可能性が考えられる

次回からはクロラムフェニコールを十分に付加すべきである

October 5

Time

9:00~

Member

福山、竹内

Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1)　ゲルを使ったDNA抽出,ライゲーション,トランスフォーメーション　[福山]

　　　ベクター　： pSB1C3(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み)

　　　インサート： ahpC,SufA(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み)

(2)　pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)の、アルカリミニプレップ　[竹内]

Method

(1)　ゲルを使ったDNA抽出,ライゲーション,トランスフォーメーション

　青ゲルを使って、前日に制限酵素処理をしたpSB1C3,ahpC,SufAをそれぞれ電気泳動した

　↓バンドを切り取った(pSB1C3は観察された2本のバンドのうち、サイズが大きい方を切り取った)

　↓切り取ったahpC,SufAを別々のエッペンドルフチューブに入れ、pSB1Cは2分割してそれぞれ

　ahpC,SufAが入ったエッペンに入れた

　　(以下はこの2つの試料のうち、1試料分の実験手順を書いた)

　↓フェノールを等量加え、ボルテックス

　↓5分間遠心した(4℃, 14500 rpm)

　↓上清を回収した

　↓フェノールクロロフォルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加え、ボルテックス

　↓5分間遠心した(25℃, 13000 rpm)

　↓上清を回収した

　↓酢酸ナトリウムを50 μl,イソプロパノールを800 μl加えた

　↓10分間遠心した(4℃, 14500 rpm)

　↓上清を捨てた

　↓70%エタノールを500 μl加えた

　↓5分間遠心した(4℃, 14500 rpm)

　↓上清を捨てた

　↓乾燥させて、MilliQを10 μl加え、2xLigation Mixを10 μl加えた

　↓16℃に30分間置いた

　↓DH5α懸濁液を100 μl加えた

　↓氷上に30分間置いた

　↓42℃に30分間置いた

　↓氷上に2分間置いた

　↓soc培地を900 μl加えた

　↓37℃で1時間振とう培養した

　↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した

　↓37℃で一晩インキュベートした

(2)　pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)の、アルカリミニプレップ

　前日の14時から今日の午前まで培養していたDH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))を

　遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた

　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え

　↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)

　↓上清を新しいチューブに移した

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15000 rpm)

　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15000 rpm)

　↓カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し替えた

　↓カラムにMilli Qを100 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた

　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)

　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた

　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)

　↓上清を捨て、乾燥させた

　↓それぞれの乾燥DNAを30 μlのMilli Qに溶かした

　このうち1 μlずつとってMilli Qで100倍希釈した溶液の吸光度(260nm)を測定した

Results

(1)　特に結果として示せるものはなかった

トランスフォーメーションができていれば明日コロニーが観察されると思われる

(2)　得られた7試料の濃度に関して、

ahpCの2試料はそれぞれ266ng/μl,390ng/μl,

sufAの5試料はそれぞれ303ng/μl,223ng/μl,223ng/μl,140ng/μl,302ng/μlであった

これより、十分な濃度の試料が得られた

October 6

Time

Member

福山、竹内

Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)), DH5α(pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ　[福山]

(2)　前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA), pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]

Method

(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)), DH5α(pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ

　前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが見られたので

　ピックアップして、それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、37℃で振5時間程振とう培養した

　↓遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた

　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)

　↓上清を新しいチューブに移した

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓カラムを新しいエッペンに移し替えた

　↓カラムにMilliQを100 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた

　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)

　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた

　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)

　↓上清を捨て、乾燥させた

　↓5 μlのMilli Qに溶かし4℃で保存した。そのうち1 μlはErBr入りのアガロースゲルを使って電気泳動した(*2)

(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス

　Premix 2 μl

　5xsequence buffer 1 μl

　Primer(1 μM) 1.6 μl

　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した

　総量 10 μl

表1: PCR設定
Pre Denature	Denature	Annealing	Extention	+Extention
96℃	96℃	50℃	60℃	4℃
1min	10sec	5sec	4min	∞
	30サイクル

エタノール沈殿

　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した

　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた

　↓氷上で15分間冷やした

　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた

　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた

　↓50 μlの70 % エタノールを加えた

　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた

　↓乾燥させた(よく乾かした)

　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした

　↓95 ℃で2分加熱した

　↓氷上で冷やした(急冷)

　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った

　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した

　↓シークエンス用の蓋をした

　↓シークエンサーに入れた

Results

(1)　(*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったので、

DNAの濃度を確かめる為に(*2)で電気泳動を行いバンドが見られるか確認した

その結果、バンドが観察されたので、明日以降PCRを行うのに有効なDNA試料であると思われる

(2)　十分に正確な塩基配列を読むことができなかった

Consideration

(1)　(*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったのは、培養時間が短く

(今回は5時間だったが、ベクターがpSB1C3の時は、今まではたいてい10時間以上培養していた)

DH5αが十分に増殖しておらず、プラスミドの濃度が低かったからだと思われる

(2)　コンタミの可能性が考えられる

October 7

Time

18:00~

Member

福山、竹内

Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ　[福山]

(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]

Method 【実験方法】

(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ

　前日の14時から今日の午前まで培養していたDH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))を

　遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた

　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)

　↓上清を新しいチューブに移した

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し替えた

　↓カラムにMilliQを100 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた

　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)

　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた

　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)

　↓上清を捨て、乾燥させた

　↓それぞれの乾燥DNAを30 μlのMilliQに溶かした

　　このうち1 μlずつとってMilliQで100倍希釈した溶液の吸光度(260nm)を測定した

(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス

　H₂O 全量10 μlになるように調整した

　Premix 2 μl

　5xsequence buffer 1 μl

　Primer(1 μM) 1.6 μl

　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した

　総量 10 μl

表1: PCR設定
Pre Denature	Denature	Annealing	Extention	+Extention
96℃	96℃	50℃	60℃	4℃
1min	10sec	5sec	4min	∞
	30サイクル

エタノール沈殿

　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した

　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた

　↓氷上で15分間冷やした

　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた

　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた

　↓50 μlの70 % エタノールを加えた

　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた

　↓乾燥させた(よく乾かした)

　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした

　↓95 ℃で2分加熱した

　↓氷上で冷やした(急冷)

　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った

　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した

　↓シークエンス用の蓋をした

　↓シークエンサーに入れた

Results (1)100倍希釈したDNA溶液の吸光度の測定結果を表2に示す

表2: 吸光度測定結果
	ahpC-1	ahpC-2	sufA-1	sufA-2
	0.066	0.118	1.005	0.022
	0.053	0.114	0.681	0.023
	0.055	0.111	0.492	0.024
	0.048	0.106	0.448	0.016
	0.047	0.103	0.328	0.015
			0.276
平均	0.0538	0.1104	0.5383	0.02
希釈前の濃度 (ng/μl)	269	552	2692	100

(2)　後日、シークエンス結果を得たが、十分に塩基配列を読めていなかった

Consideration

(2)　RNA処理が十分に行われたいなかった可能性が高い

次回からはアルカリミニプレップなどでのRNA処理を十分にすべき

October 8

Time

10:30~

Member

福山、竹内

Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1)　pSB6A1(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップ　[福山]

(2)　前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]

Method

(1)　pSB6A1(ahpC,GFP)のアルカリミニプレップ

　前日から培養していたpSB6A1(ahpC,GFP)を

　遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた

　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)

　↓上清を新しいチューブに移した

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15000 rpm)

　↓カラムを新しいエッペンに移し替えた

　↓カラムにMilliQを100 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15000 rpm)

　↓溶出液を4℃で保存した

(2)　前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス

　Premix 2 μl

　5xsequence buffer 1 μl

　Primer(1 μM) 1.6 μl

　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した

　総量 10 μl

表1: PCR設定
Pre Denature	Denature	Annealing	Extention	+Extention
96℃	96℃	50℃	60℃	4℃
1min	10sec	5sec	4min	∞
	30サイクル

エタノール沈殿

　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した

　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた

　↓氷上で15分間冷やした

　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH₂Oを加えた

　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた

　↓50 μlの70 % エタノールを加えた

　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた

　↓乾燥させた(よく乾かした)

　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした

　↓95 ℃で2分加熱した

　↓氷上で冷やした(急冷)

　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った

　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した

　↓シークエンス用の蓋をした

　↓シークエンサーに入れた

Results

(1)　濃度測定をしなかったので、特に結果として残すものはなかった

(2)　試料ahpC-1に関しては正しい塩基配列を読むことができた

Consideration

(2)　ahpC-1以外の試料の正確な塩基配列が読めなかった理由としてDNA濃度が不十分であった可能性がある

October 9