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September 26

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Time

9：00～

Member

福山,臼井,革島,中村

Fkuyama,Usui,Kawashima,Nakamura

Purpose

(1)　promoter less RFP、pSB1C3のミニプレ→制限酵素処理　[革島]

(2)　各プロモーター入GFP on pSB6A1の制限酵素処理　[中村]

(3)　pSB1C3のゲル抽出　[福山]

(4)　ahpC,sufAの蛍光強度測定実験　[臼井]

Method

(1)　promoter less RFP、pSB1C3のミニプレ→制限酵素処理

　＊ミニプレ

　　　9/15カラム不使用のミニプレ参照

　　　最後はRNase 20ng/μL入りMilliQ(50倍希釈) 30μLに溶かした

　＊制限酵素処理

　　　pSB1C3：DNA濃度10万ng分をEcoRⅠ、pstⅠ1μL用い、Total　25μLで処理した(8本)

　　　promoter less RFP：DNA濃度10万ng分をEcoRⅠ、XbaⅠ1μL用い、Total　25μLで処理した(3本)

(2)　各プロモーター入GFP on pSB6A1の制限酵素処理

　各プロモーター(acrAB、ahpC、dps、oxyR、sodA、sufA、yaiA)

　の入ったpSB6A1をE-Pcutした(Overnight)

</TR>

表1: 制限酵素処理試薬組成
	acrAB	ahpC	dps	oxyR	sodA	sufA	yaiA
DNAsol	8.8μL	5.5μL	8.56μL	7.1μL	6.96μL	8.7μL	6.2μL
EcoRⅠ	1μL
PstⅠ	1μL
10xH	2.5μL
Milli Q	Final　25μLに調整

(3)　pSB1C3のゲル抽出

　4種類の濃度（3589.8ng/μlが1試料,2393.2ng/μlが3試料,1196.6ng/μlが2試料,598.3ng/μlが1試料）

　pSB1C3計7試料(全量はそれぞれ50 μl)に3 μlずつCIAPを加えた

　↓前日に作成した1％青ゲルを使って100Vで25分間電気泳動した

　　確認のため、同時に各試料5 μlずつとって1％アガロースゲルを使って135Vで15分間電気泳動した

　↓確認のための電気泳動でバンドが確認できたので、バンドが見えなかった青ゲルをさらにEtBrで20分間染色した

　↓UVを照射してバンドを確認できたので、ゲルを切り出した

　↓各バンドの試料につき400 μlずつMilliQを加えた

　↓フェノールを430 μlほど加えた

　↓遠心（13,000 rpm、5分間、25℃）

　↓上清を回収

　↓フェノールクロロフォルムをエッペンチューブの8割ほど加え、vortex

　↓遠心（13,000 rpm、5分間、25℃）

　↓上清を回収

　↓酢酸ナトリウムを50 μlずつ、イソプロパノールを800 μlずつ加えた

　↓遠心（14,500 rpm,30分間,4℃）

　↓上清を捨て、70％エタノールを500 μlずつ加えた

　↓遠心（14,500 rpm,30分間,4℃）

　↓上清を捨て、乾燥させた

　↓TEを11 μlずつ加えた

　↓冷凍庫で保存

(4)　ahpC,sufAの蛍光強度測定実験

　菌液濁度(O.D.₆₀₀)を0.4~0.6に調整した

　↓終濃度がlessおよび1nM～1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した

　↓37℃でインキュベートし、10分ごとに菌液500μLずつ回収した

　↓cfg.4℃ 14,000rpm,1min

　↓上清を除いた

　↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した

　↓全量を蛍光強度測定に用いた

　　※この操作を80分まで行った

Results

(1)

表2: 濁度測定
	RFP 1	RFP 2	RFP 3	RFP 4	RFP 5	RFP 6	RFP 7	pSB1C3
OD₂₆₀	0.753	0.589	0.756	0.505	0.503	0.517	0.456	0.570
DNA濃度	18825	14725	18825	12625	12591	12925	11400	14250
全量	28	29	29	29	29	29	29	29