Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September23

• Amplifiable BAC plasmid([http://partsregistry.org/Part:BBa_J61031 BBa_J61031]) Purification
• Colony PCR of AraC+RBS+pSB1A3
• DH5αとMG1655へのBac Vecterのelectroporetion

Bac Vecter Purification

miniprepはQiagenのminiprep kit,qiaprepを用いて行った。

1)昨日から培養してあったBac　Vector保有株を1.3ml,1.5mlエッペンチューブに移した。

2)4C、15000rpmで1min遠心を行った。細胞塊が沈殿した。

3)上澄みを捨て、残りのサンプルをチューブに移した。

4)4C、15000rpmで1min遠心を行った。細胞塊が沈殿した。

5)上澄みを捨て、4℃で保存していたBuffer P1を250　ul加え、voltexにかけた。細胞塊は見えなくなった。

6)Buffer P2を250 ul加え、静かに数回転倒混和した。溶液の色が緑色に変化した。

7)Buffer N3を350 ul加え、すぐに数回転倒混和した。溶液が白濁した。

8)4C,13000rpmで10min遠心した。

9)上澄みをピペットマンで専用のカラムに移し、4C,13000rpm,1min遠心した。

10)下澄み液を捨て、500 ulのBuffer PBを加えて4C,13000rpm,1minで遠心を行った。

11)下澄み液を捨て、さらに1min遠心した。

12)新しい1.5 ml チューブにカラムを移し、TEを50 ul加えて1min放置した。

13)4C,13000rpm,1min遠心を行った。

14)-20Cで凍結保存した。

AraC+RBS+pSB1A3のコロニーPCR

1. コロニーを無作為に16個選び、番号を振った。
2. 0.5 mLチューブを16本用意し、それぞれにDWを10 uLずつ分注した。
3. チューブに番号を振り、対応するコロニーを懸濁した。
4. コロニーPCR溶液を以下の組成に従って調整した。