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September 12

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Time

10：00～

Member

古道、竹内、革島

Furumichi,Takeuchi,Kawashima

Purpose

(1)　一晩37℃振とう培養したpSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)のアルカリミニプレップ、濃度測定　[古道]

(2)　一晩制限酵素処理したinverted LacZ 1,2、pSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、

pSB6A1-J04450(RFPプロモーターあり)、プロモーターレスLacZのDNA抽出　[古道]

(3)　CFP on pSB6(lowcopy vecter)、YFP on pSB6(lowcopy vecter)に

ライゲーション済の各プロモーター(dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA)のピックアップ　[古道]

(4)　E0240,K121013,TetR,AcrAB,dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA,yaiAの培養　[革島]

Method

(1)　一晩37℃振とう培養したpSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)のアルカリミニプレップ、濃度測定

　遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓吸光度測定(100倍希釈)した

(2)　一晩制限酵素処理したinverted LacZ 1,2、pSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、

pSB6A1-J04450(RFPプロモーターあり)、プロモーターレスLacZのDNA抽出

　一晩制限酵素処理したpSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、

　pSB6A1-J04450(RFPプロモーターあり)にCIAPを3µl加え、37℃で30分間インキュベートした

　↓アルカリフォスファターゼ処理し終えたpSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、

　　pSB6A1-J04450　　(RFPプロモーターあり)と一晩制限酵素処理したinverted LacZ 1,2、

　　プロモーターレスLacZを1％青ゲルに流し50Vで60分間電気泳動した

　↓ゲルの切り出しができそうなinverted LacZ 2とプロモーターレスLacZのゲルを切り出した

　↓切りだしたゲルの重さを事前に量った

　↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート

　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH₂Oを37μL加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓保存

(3)　CFP on pSB6(lowcopy vecter)、YFP on pSB6(lowcopy vecter)に

ライゲーション済の各プロモーター(dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA)のピックアップ

　以下のUVに照らして光っていたコロニーと光っていなかったコロニーもピックアップし、

　アンピシリン入りのLBプレートにストリークした

　　　dps(YFP)

　　　ahp(CFP,YFP)

　　OxyR(CFP,YFP)

　　　SufA(CFP)

　　　SodA(CFP)

　↓37℃、一晩インキュベートした

(4)　E0240,K121013,TetR,AcrAB,dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA,yaiAの培養

　E0240,K121013,TetR,AcrAB,dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA,yaiAの培養

　3μLのLB培地のはいった、オートクレーブ済みの試験官に3μLずつamp50mL/mgを加えた

　↓E0240,K121013,TetR,AcrAB,dps,ahpC,SufA,SodA,yaiAをそれぞれ2本ずつ試験官に植菌した

　　OxyRは4本植菌した

　↓over nightでインキュベート

Results

(1)　吸光度測定結果を以下に示した

吸光度測定(100倍希釈)
	0.023
	0.021
	0.011
	0.012
	0.017
	0.012
	0.017
	0.019
平均	0.017
濃度	0.017×100×50＝85(µl/ml)

(2)　ゲル抽出したinverted LacZ 1,2、pSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、

pSB6A1-J04450(RFPプロモーターあり)、プロモーターレスLacZらを次回吸光度測定しDNA濃度を求める

その結果DNA濃度は薄く実験に使用できる濃度に満たなかった

(3)　ストリークしたdps(YFP)、ahp(CFP,YFP)、OxyR(CFP,YFP)、SufA(CFP)、SodA(CFP)は

次の日にすべて生えていたのが確認できた

(4)　全て生えていた

September 13

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Time

9:00～

Member

福山,竹内,中村,吉村

Fukuyama,Takeuchi,Nakamura,Yoshimura

Purpose

(1)　GFP(pSB6A1,OxyR),pSB1A2(BBa-E0240)のアルカリミニプレップ　[中村]

(2)　GFP(pSB6A1,OxyR),pSB1A2(BBa-E0240)の制限酵素処理　[中村]

(3)　過酸化水素の反応実験　[吉村]

(4)　High Copy,Low Copyの比較追加実験　[吉村]

(5)　OxyR、pSB1C3 の吸光度測定　[中村]

(6)　acrABのPCR・制限酵素処理　[吉村]

(7)　yaiAの吸光度測定と制限酵素処理　[福山]

(8)　ゲル抽出を終えたInverted LacZとｐSB1A2(BBa_I732019)の吸光度測定　[福山]

(9)　新しいマスタープレートの作成　[福山]

　 DH5α: pSB1A2(BBa_E0240)

　　　　　pSB1A2(BBa_I13507)

　　　　　pSB1A2(BBa_R0040)

　　　　　pSB1A2(BBa_I13522)

　　　　　pSB1K3(BBa_I1732950)

　　　　　pSB1A2(BBa_J22005)

　　　　　pSB1A2(BBa_E0420)

　　　　　pSB4A5(BBa_K193602)

(10)　マスタープレートから液体培地への植え継ぎ　[福山]

　 DH5α: pSB6A1(BBa_J04450)

　　　　　pSB1A2(BBa_E0420)

　　　　　pSB3K3(BBa_J04450)

　　　　　pSB1A2(BBa_E0430)

Method

(1)　GFP(pSB6A1,OxyR),pSB1A2(BBa-E0240)のアルカリミニプレップ

　GFP(pSB6A1,OxyR),pSB1A2(BBa-E0240)について同様の操作を行った

　(以下、OxyR、E0240と記載)

　菌液は試験管2本分(約6mL)である

　1.5mLエッペンドルフチューブに菌液を移した　　　　　

　↓cfg 20℃ 13,000rpm 1min

　↓上清を捨てた(以上の操作を菌液を全量使うまで行う)

　↓冷蔵していたSolutionⅠ250μｌ加えてピペッティングし、Vortexで混合

　↓SolutionⅡを250μl加え、軽く振った

　↓SolutionⅢを350μl加え、タンパク質が生じるまでよく混合

　↓cfg 20℃ 13,000pm 5min*

　↓上清をカラムに移した

　↓cfg 20℃ 13,000pm 1min

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓cfg 20℃ 13,000pm 1min

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓cfg 20℃ 13,000pm 1min(×2)

　↓抽出液を捨てた(×2)

　↓滅菌水100μLをカラムに入れた

　↓cfg 20℃ 13,000pm 1min

　↓溶出液を回収

　*OxyRに関して、一回の遠心で十分な上清が得られなかった為、

　cfg　20℃　14,500rpm　3minで再度上清とタンパク質を分離した

　しかしながら、結局カラム上部の半分程度しかOxyRの上清は得られなかった

(2)　GFP(pSB6A1,OxyR),pSB1A2(BBa-E0240)の制限酵素処理

　ミニプレ後のOxyR、E0240を制限酵素処理するために濃度を測定した

　吸光度の測定結果を以下の表1に示した

　表1より各濃度は

　　　OxyR　180ng/μL

　　　E0240 792ng/μL　であった

　この結果を受けて、下表2の組成で制限酵素処理を行った

表1: OxyR、E0240の吸光度
×1/100 OxyR E0240
1回目	0.036	0.170
2回目	0.035	0.155
3回目	0.036	0.156
4回目	0.036	0.158
5回目	0.034	0.153
Ave.	0.036	0.158

表2: 制限酵素処理試薬組成
	OxyR	E0240
DNAsol	99μL	92μL
EcoRⅠ	1.78μL	8.2μL
XbaⅠ	1.98μL	9.0μL
Buffer M	15μL	15μL
H₂O	32.2μL	25.8μL
total	150μL	150μL

(3)　過酸化水素の反応実験

　プレートを8分割して、それぞれの区画に時計回りに

　AcrAB(18番)、AcrAB(26番)、SodA(19番)、yaiA(23番)、ahpC(7番)、TetR(on pSB6)、K121013(pSB6)をストリークした

　このプレートを37℃のインキュベーターの中に入れた(overnight)

(4)　High Copy,Low Copyの比較追加実験

　pSB6 TetR-GFP

　pSB1A2 I13522　を各2本ずつ試験管に培養した

　培養後、プラスミド抽出をした

　各サンプルを培養した

　(培養条件　時間　mlのLB(ampicilin 終濃度50ul/ml))

　↓Cfg.14,000rpm 30secで遠心したのち、50ulのsol3を加えた

　↓本来ならばsol1を加えるところを間違えたので400ulのsol1で懸濁し、洗った

　↓Cfg.14,000rpm 30secで遠心したのち、100ulのsol1を加えた

　↓vortexにより懸濁したのちsol2を200ul加え、2分後にsol3を150ul加えた

　↓Cfg.14,000rpm 10minで遠心したのち、上清を回収し、200ulのフェノール/CIAAを加えた

　↓vortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5minで遠心した

　↓上清を回収し、さらにCIAAを200ul加えvortexで混合した後Cfg.14,000rpm 5minで遠心した

　↓上清を回収し、500ulのイソプロパノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した

　↓上清を取り除き200ulの70％エタノールを加え、Cfg.14,000rpm 10minで遠心した

　↓上清を取り除いた後、サンプルを乾燥させ(TOMY micro vac MV-100 30sec)50ulのmilliQに溶解させた

　以上の操作において、sol1,sol2,sol3は以下のものを用いた

　　Sol1: 50mM グルコース, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA

　　Sol2: 0.2N NaOH, 1%SDS

　　Sol3: 5M CH₃COOK,CH3COOH

(5)　OxyR、pSB1C3 の吸光度測定

　以前保存していたOxyR、pSB1C3(乾燥状態x5)、pSB1C3(30μLスケールx3)についてそれぞれ吸光度測定を行った

表3: OxyRの吸光度
	x1/20 OxyR
1回目	0.022
2回目	0.020
3回目	0.020
4回目	0.024
5回目	0.020
Ave.	0.0225

表4: 2種類のpSB1C3の吸光度
	x1/100 pSB1C3Ⅰ	pSB1C3Ⅱ	pSB1C3Ⅲ	pSB1C3Ⅳ	pSB1C3Ⅴ
1回目	0.011	0.008	0.013	0.008	0.005
2回目	0.012	0.007	0.016	0.008	0.007
3回目	0.011	0.008	0.011	0.012	0.005
4回目	0.012	0.011	0.012	0.017	0.006
5回目	0.012	0.010	0.013	0.010	0.004
Ave.

　pSB1C3Ⅰ～ⅢはpSB1C3(30μLスケールx3)であり、pSB1C3Ⅳ、ⅤはpSB1C3(乾燥状態x5)の内の2本である

(6)　acrABのPCR・制限酵素処理

　PCRを下表5,6の条件で行った

　PCRが終わった後、吸光度を測定した

　この結果を受けて、下表7の組成で制限酵素処理を行った（37℃ overnight）

表5: PCR試薬組成
鋳型DNA	0.5ul
MgSO₄	4ul
dNTP	5ul
KODplus	1ul
Primer(PM) (AcrAB)	1.5ul
Buffer	5ul
MilliQ	33ul
Total	50ul

表6: PCRプログラム
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	60.2℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	30sec	2min	保持
	35サイクル

表7: 制限酵素処理
DNAsol 99μL
EcoRⅠ	2.36μL
SpeⅠ	1.31μL
Buffer(H)	15μL
H₂O	32.33μL
total	150μL

(7)　yaiAの吸光度測定と制限酵素処理

　前日にPCRを終えたyaiAの吸光度（260nm）を測定した

　吸光度の測定結果を下表8に示す

　この結果を受けて、下表9の組成で制限酵素処理を行った（37℃　Overnight）

表8: yaiAの吸光度
	x1/20 yaiA
1回目	0.386
2回目	0.376
3回目	0.384
4回目	0.376
5回目	0.371
Ave.	0.3786

表9: 制限酵素処理試薬
DNAsol	226μL
EcoRⅠ	8.6μL
SpeⅠ	4.8μL
Buffer(H)	41.1μL
H₂O	130.6μL
total	411μL

(8)　ゲル抽出を終えたInverted LacZとｐSB1A2(BBa_I732019)の吸光度測定

　前日にPCRを終えたInverted lacZと、ｐSB1A2(BBa_I732019)吸光度（260nm）の測定を行った

(9)　新しいマスタープレートの作成

　Amp入りのLB寒天培地にある

　 DH5α: pSB1A2(BBa_E0240)

　　　　　pSB1A2(BBa_I13507)

　　　　　pSB1A2(BBa_R0040)

　　　　　pSB1A2(BBa_I13522)

　　　　　pSB1K3(BBa_I1732950)

　　　　　pSB1A2(BBa_J22005)

　　　　　pSB1A2(BBa_E0420)

　　　　　pSB4A5(BBa_K193602)

　を、新たにAmp入りの(pSB1K3(BBa_I1732950)はカナマイシン入りの)

　LB寒天培地にストリークして37℃でインキュベートした

(10)　マスタープレートから液体培地への植え継ぎ

　LB寒天培地にある

　 DH5α: pSB6A1(BBa_J04450)

　　　　　pSB1A2(BBa_E0420)

　　　　　pSB3K3(BBa_J04450)

　　　　　pSB1A2(BBa_E0430)

　をpSB1A2,ｐSB6A1はAmp入りの3mlLB液体にうえつぎして、

　pSB3K3はカナマイシン入りの3mlLB液体にうえつぎして一晩培養した　　　　

Results

(1,2)　37℃で3.5hインキュベートの後、OxyR、E0240共に冷蔵保存した

(3)　全ての大腸菌でコロニーの生育が確認できた

　肉眼による蛍光強度は、TetRが最も強く、ahpCがその次に強かった

　AcrAB,SodA,yaiAに関しては蛍光がみられなかった

　(蛍光タンパク質を発現しないK121013と蛍光強度が同じくらいだった)

(4)　どちらのベクターとも十分なDNA濃度だった

(5)　吸光度測定の結果、このままの状態で制限酵素処理には移れないと判断したため14日に濃縮予定

(6)　吸光度の測定結果を以下に示す

表10:　acrABの吸光度
x1/100 acrAB
1回目	0.049
2回目	0.047
3回目	0.048
4回目	0.047
5回目	0.047
Ave.	0.0476

この結果より、acrABの濃度は 238ng/μL であった

(7)　制限酵素処理がうまくいっているかどうかは今日はまだ分からない

(8)　Inverted lacZと、pSB1A2(BBa_I732019)吸光度(260nm)の測定の結果を示す

表11: Inverted lacZの吸光度
	x1/20 Inverted lacZ
1回目	0.017
2回目	0.020
3回目	0.020
4回目	0.019
5回目	0.019
Ave.	0.019

この結果をもとに算出したInverted　lacZの濃度：95ng/μl

表12: pSB1A2(BBa_I732019)の吸光度
	x1/20 pSB1A2(BBa_I732019)
1回目	0.012
2回目	0.019
3回目	0.018
4回目	0.014
5回目	0.013
Ave.	0.0152

この結果をもとに算出したpSB1A2(BBa_I732019)の濃度：15.2ng/μl

(9)　きちんと培養できているかは今日はまだわからない

(10)　明日以降、培養が成功していればにアルカリミニプレップを行う

Consideration

(1)　OxyRの上清が十分に得られなかった理由として、

Overnightで振とう培養(常温)したため菌体が増えすぎた可能性が考えられる

(8)　Inverted lacZ、pSB1A2(BBa_I732019)ともにあまり濃いDNA試料とはいえない

September 14

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Time

9:00～

Purpose

福山,竹内,臼井,革島,中村

Fukuyama,Takeuchi,Usui,Kawashima,Nakamura

Purpose

(1)　inverted LacZ,プロモーターless LacZ,pSB1C3のエタノール沈殿→吸光度測定　[中村]

(2)　ahpC GFP(on pSB6A1)の培養　[中村、革島]

(3)　pSB1C3の培養　[革島]

(4)　プロモーターless LacZの培養　[革島]

(5)　TetR-GFP(on pSB6),TetR-GFP(on pSB1(I13522))の濃度測定　[臼井]

(6)　H₂O₂ stockの作成　[臼井]

(7)　sufA,SodA,ahpCのPCR　[臼井]

(8)　ahpC,oxyR,sufA+LacZ on pSB6のライゲーション　[革島、臼井]

(9)　pSB1A2(BBa_E0420)のアルカリミニプレップと濃縮　[福山]

(10) アルカリミニプレップを終えたTetR-GFP(on pSB6),TetR-GFP(on pSB1(I13522))の濃縮　[福山]

Method

(1)　inverted LacZ,プロモーターless LacZ,pSB1C3のエタノール沈殿→吸光度測定

　イソプロパノール、酢酸ナトリウムを下表1のように加えた

　↓cfg　20℃　13,000rpm　10min

　↓上清を捨てた

　↓70%EtOHを100μL加えた

　↓cfg　20℃　13,000rpm　5min

　↓70%EtOHを除いた

　↓遠心乾燥

　↓H₂O 30μLに溶かした

　↓それぞれ20倍希釈で吸光度を測定した

表1: 試薬組成
	inverted LacZ	promoterless LacZ	pSB1C3
isopropanol	37μL	74μL	98μL
CH₃COONa	3.7μL	7.4μL	9.8μL

(2)　ahpC GFP(on pSB6A1)の培養

　試験管2本にLB液体培地(amp+)を2mL加えた

　↓白金耳を良くあぶってから冷ました後、ahpC GFP(on pSB6A1)7を掻きとり試験管に培養した

　↓これを２回繰り返した

(3)　pSB1C3の培養

　試験管6本にLB液体培地(amp-)を4mL加え、クロラムフェニコール4μLを加えた

　↓白金耳を良くあぶってから冷ました後、pSB1C3(J04450)を掻きとり試験管に培養した

　↓これを６回繰り返した

(4)　プロモーターless LacZの培養

　LB液体培地3μLの入ったオートクレーブ済みの試験管4本にアンピシリン50mg/μLを3μL加えた

　↓白金耳を良くあぶってから冷ました後、プロモーターless LacZの培養を掻きとり試験管に培養した

　↓これを4回繰り返した

(5)　TetR-GFP(on pSB6),TetR-GFP(on pSB1(I13522))の濃度測定

　前日(13日)にアルカリミニプレップによって抽出した

　TetR-GFP(on pSB6),TetR-GFP(on pSB1(I13522))の濃度測定

　　　　※100倍希釈で620nmの吸光度を測ったとき、

　　　　　吸光度が両方とも2.0以上の値になってしまったので、500倍希釈で濃度を計算した

　TetR-GFP(on pSB6),TetR-GFP(on pSB1(I13522))それぞれ1μLを99μLのH₂Oで希釈し、

　この100倍希釈溶液20μLを80μLのH₂Oで希釈した

　↓それぞれに関して5回ずつ吸光度を測った

　↓それぞれの平均値から濃度を計算した

(6)　H₂O₂ stockの作成

　以下は各濃度全量1.8mLに値するプロトコルである

　H₂O 1200μLに30% H₂O₂ 1000μLを加え、4M H₂O₂ 2.2mLを作成した

　※H₂OにH₂O₂を加えるようにする

　↓滅菌

　↓4M H2O2 500μL + H2O 1500μL　[1M H2O2 2mL]

　↓1M H2O2 200μL + H2O 1800μL　[100mM H2O2 2mL]

　↓100mM H2O2 200μL + H2O 1800μL　[10mM H2O2 2mL]

　↓以下同様にして10分の1希釈していき1nM H2O2 2mLまで作成した

　※以下、取り扱いと保存方法

　・取り扱いに関して必ず手袋着用のこと

　・冷蔵保存

(7)　sufA,SodA,ahpCのPCR　[臼井]

　下表2の組成で各2本ずつ作成した

　↓下表3のプログラムでPCR反応を行った

表2: 試薬組成
Primer PM(sufA,SodA,ahpC)	1.5μL
テンプレートDNA	0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-	5μL
2mM d NTPs	5μL
2mM MgSO₄	4μL
Milli Q	33μL
KOD-Plus-	1μL
全量	50μL

表3: PCRプログラム
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	59℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	1min	2min	保持
	35サイクル

(8)　ahpC,oxyR,sufA+LacZ on pSB6のライゲーション

　↓下表4,5,6に従い試薬をチューブに加えた

　↓16℃30min water bath

　↓LigationしたsufA,ahpC,oxyR(LacZ-On pSB6)全量にDH5αを50μL加えon ice 3min.

　↓30sec. 43℃でヒートショックを与えた

　↓on ice 10min.

　↓SOC培地0.9mlを加え、37℃-30min.で回復培養を行った

　↓プレートにまき37℃-overnightで培養

表4: [A] SufA insert:vector=1:2
Insert(SufA)	0.65μl
Vevtor(LacZ-On pSB6)	9μl
Milli Q	0.35μl
Ligation Mix	10μL
Total	20μl

表5: [B] ahpC insert:vector=1:2
Insert(ahpC)	0.65μl
Vevtor(LacZ-On pSB6)	9μl
Milli Q	0.35μl
Ligation Mix	10μL
Total	20μL

表6: [C] OxyR insert:vector=1:2
Insert(OxyR)	0.65μl
Vevtor(LacZ-On pSB6)	9μl
Milli Q	0.35μl
Ligation Mix	10μL
Total	20μl

(9)　pSB1A2(BBa_E0420)のアルカリミニプレップと濃縮

　前日から培養していたDH5α(pSBA1A2(BBa_E0420))

　遠心1分(25℃、14,500rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(25℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(25℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(25℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(25℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水100μlをカラムに入れた

　↓遠心30秒(25℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓溶出液を48μlずつ2つの1.5mlエッペンチューブに分注した

　↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

　↓一方の試料は遠心10分(25℃、14,500rpm)、もう一方の試料は遠心40分(25℃、14,500rpm)

　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに8割ほど加えた

　↓遠心5分(25℃、14,500rpm)

　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

　↓Milli Qをそれぞれ15μlずつ加えた

　↓それぞれの試料を20倍希釈で吸光度を測定した

(10) アルカリミニプレップを終えたTetR-GFP(on pSB6),TetR-GFP(on pSB1(I13522))の濃縮

　アルカリミニプレップを終えたTetR-GFP(on pSB6)とTetR-GFP(on pSB1(I13522))を6倍希釈した

　　　　事前に吸光度測定をし、濃度は非常に高いと分かっているため

　　　　希釈した今回は濃縮の操作がちゃんとできるかを確認することを目的としている

　酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

　↓TE(10μlTris-HCl pH8.0/1mM EDTA)をそれぞれ120μlずつ加え、冷蔵庫で保管した

Results

(1,2)　吸光度測定の結果を以下に示す

表7: 吸光度測定
x1/20	inverted LacZ	プロモーターless LacZ	pSB1C3
OD₂₆₀	0.024	0.012	0.021
DNA量	24ng/μL	12ng/μL	21ng/μL
全量	24μL	25μL	25μL

(3,4)　共に培養できていた

(5)　結果を以下に示した

(吸光度(OD₂₆₀) 1/500)

表8: TetR-GFP(on pSB6)
1	0.603
2	0.613
3	0.604
4	0.604
5	0.602
Ave	0.6052
濃度：15130ng/μL

表9: TetR-GFP(on pSB1(I13522))
1	0.575
2	0.581
3	0.576
4	0.574
5	0.568
Ave	0.5748
濃度：14370ng/μL

(6)　以後H₂O₂の付加実験で使用

(7)　PCR産物は以後の実験で使うためのストックとして保存(この時点では濃度は測っていない)

(8)　ストリークし、コロニーが生えたのち、

15日以降にHigh Copy Vectorにライゲーションしたものとで比べる実験で使用

(9)　吸光度の測定結果を表9と表10に示す

表10: 遠心時間が10分間のもの(OD₂₆₀)
1	0.008
2	0.006
3	0.007
4	0.007
5	0.006
Ave	0.0068

表11: 遠心時間が40分間のもの(OD₂₆₀)
1	0.023
2	0.019
3	0.021
4	0.023
5	0.020
Ave	0.0212

　酢酸ナトリウムとイソプロパノールを入れた後の遠心の時間が長かったほうが、3倍ほど濃度が高いDNA溶液を得られた

　また、どちらも酢酸ナトリウムとイソプロパノールを入れた後の遠心後にDNAの沈殿は見えなかった

(10)　濃縮後の吸光度の測定はしなかったが、

酢酸ナトリウムとイソプロパノールを入れた後の遠心後にDNAの沈殿がはっきりと見られた

Consideration

(1,2)　ゲル抽出後の濃度であることから、ライゲーションには耐え得ると考えられる

しかしながら、エタ沈の時点でDNAが目視できなかったことから、

やはり現状のアルカリミニプレップには何らかの問題があると考えられる

(5)　前日のミニプレ(カラムを使用していない)で得たDNA量(濃度)がとても大きい値なので、

以降ミニプレを行う際に失敗しないよう13日のミニプレを参考にするのがよいかと思う

(9)　濃縮は、酢酸ナトリウムとイソプロパノールを入れた後の遠心の時間を長くすることで

今までのような失敗を改善できるかもしれない

(10)　ある程度の濃度でDNAが回収できていれば、濃縮の過程できちんとDNAの沈殿が見られる

しかし、吸光度を測定しなかったので、本当に濃縮できているのかよく分からず、不十分な実験となってしまった

September 15

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【時間】

9:00～

【実験担当】

臼井,革島,竹内,中村,吉村

【実験目的】

(1)　カラム使用アルカリミニプレップとカラム不使用アルカリミニプレップの比較実験

(2)　ゲル作成→エタ沈→ゲル抽→吸光度→ライゲーション→トランスフォーメーション

(3)　本部提出用のSodA,sufA,ahpC,OxyRのPCRと制限酵素処理

(4)　過酸化水素濃度比較実験

【実験内容】

(1)　カラム使用アルカリミニプレップとカラム不使用アルカリミニプレップの比較実験

　RFP(promoterless, on pSB6A1)を試験管6本

　GFP(AcrAB, on pSB6A1)を試験管に4本

　GFP(dps, on pSB6A1)を試験管に4本

　それぞれ37℃のインキュベーターに3時間入れて振とう培養した

　↓培養後、半分をカラム不使用のアルカリミニプレップで処理し、

　　半分をカラムを使用したアルカリミニプレップで処理した

　カラム使用のアルカリミニプレップで処理したものをⅠ、

　カラム不使用のアルカリミニプレップで処理したものをⅡとして実験手順を以下に示す

[Ⅰ]

　培養した大腸菌を1.5mlエッペンに移し、25℃、15,000rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓Solution１を250μl加え、ピペッティング、ボルテックスした

　↓Solution２を250μl加え、4~5回上下して混ぜた

　↓Solution３を350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに流した

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を捨てた

　↓Solution４を500μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を捨てた

　↓Solution５を700μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を捨て、もう一度25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を捨て、チューブを蓋を切り取ったエッペンに取りかえた

　↓Milli Qを100μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓カラムを捨て、エッペンにイソプロパノール 800μl,CH₃COONa 50μlを加えた

　↓25℃、13,000rpmで10分間遠心した

　↓上層を捨て、70％エタノールをエッペンの8割程まで加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清を捨てた

　↓遠心乾燥器にかけた

　↓TEを30μl加えた

　↓これにより得られたサンプルの吸光度を測定した

[Ⅱ]

　菌液を1.5mLエッペンにデカンテーションで移した

　↓4℃、6,000rpmで2分間遠心した

　↓上清を捨てた

　↓この操作を菌液がすべてなくなるまで繰り返した

　↓SolutionⅠ100μLを加え、vortexにより撹拌

　↓常温で5分間放置した

　↓SolutionⅡ200μLを加え、上下に転倒させた

　↓氷上で5分間放置した

　↓SolutionⅢ150μLを加え、vortexにより撹拌した

　↓氷上で5分間放置した

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上清を新しい1.5mLエッペンに移し、ΦOH/CIAA200μLを加えてvortexにより撹拌した

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上部の水層を新しい1.5mLエッペンに移した

　↓100%EtOH 1mLを加え、上下に転倒した

　↓常温で10分間放置した

　↓4℃、15,000rpmで12分間遠心した

　↓上層を取り除いた

　↓70%EtOH 500μLを加えた

　↓4℃、15,000rpmで3分間遠心した

　↓EtOHを除いた

　↓2分間遠心乾燥した

　↓滅菌水30μLに溶かした

　↓これにより得られたサンプルの吸光度を測定した

(2)　ゲル作成→エタ沈→ゲル抽→吸光度→ライゲーション→トランスフォーメーション

右表に従い試薬を加え、これを4℃で30分間放置した
↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した
↓上清を取り除いた
↓70%EtOH 100μLを加えた
↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
↓上清を取り除いた
↓2分間乾燥させた(pSB1C3は追加でさらに4分間乾燥した)
↓MilliQ 30μLを加えた
↓それぞれにOrange Loadong Dye 6μLを加えた
↓1kbpマーカーとともに50Vで60分間電気泳動を行った
↓ゲルの切り出、その重さを量った
↓ゲルの三倍量のBuffer QGを加え、50℃で10分間インキュベートした
　(インキュベートの間は2、3分毎に振り混ぜた)
↓pSB1C3のみにCH₃COONaを3μL加えた
↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH₂Oを37μL加えた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓得られた溶液の内5μLを濃度測定に使用した

　(H₂Oを95μL加え20倍希釈とした)

	DNA	CH₃COONa	95%EtOH	計
pSB1C3	100	10	330	440
AcrAB	150	15	330	495
E0240	150	15	330	495
OxyR	150	15	330	495

E0240(ハイコピーベクター)、各種プロモーターのLigationを以下の手順で行った

　　　insert:vector=1:2

　下表1～3に従い試薬を調整した

　↓これらを16℃のウォーターバスに30分間つけた

　↓LigationしたsufA,ahpC,SodA(E0240)全量にDH5αを50μL加え3分間氷上に置いた

　↓43℃で3分間ヒートショックを与えた

　↓10分間氷上に置いた

　↓SOC培地0.9mlを加え、37℃で30分間回復培養を行った

　↓これをプレートにまき、37℃で培一晩養した

1.SufA
Insert(SufA)	0.87μl
Vevtor(E0240)	5μl
MilliQ	4.13μl
Ligation Mix	10μL
Total	20μl

2.ahpC
Insert(ahpC)	0.85μl
Vevtor(E0240)	5μl
MilliQ	4.25μl
Ligation Mix	10μL
Total	20μL

3.SodA
Insert(SodA)	2.01μl
Vevtor(E0240)	5μl
MilliQ	2.99μl
Ligation Mix	10μL
Total	20μl

(3)　本部提出用のSodA,sufA,ahpC,OxyRのPCRと制限酵素処理

　以下の組成とプログラムでSodA,sufA,ahpC,OxyRの各プロモーターについて2本ずつPCR処理を行った

プライマー(PM) (SodA,sufA,ahpC,OxyR)	0.75ul
テンプレートDNA	0.25ul
MgSO₄	2ul
dNTP	2.5ul
KODplus	0.5ul
Buffer	2.5ul
MilliQ	16.5ul
Total	25ul

Pre Denature	Denature	Annealing	Extention	+Extention
94℃	94℃	60℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	1min	2min	保持
	35サイクル

PCRの後に吸光度を測り、濃度を求めた(実験結果に詳細を示す)
次に右表の組成で制限酵素処理を行った
↓37℃でインキュベートを行った

＜組成＞
DNA	49μl
EcoRⅠ	1μl
PstⅠ	1μl
H Buffer	6μl
Milli Q	3μl
Total	60μl

(4)　過酸化水素(H₂O₂)の付加実験

　実際にH₂O₂を加え、H₂O₂応答性プロモーターを挿入したpSB6を培養した場合に、

　目で見ただけでGFPの蛍光強度の変化がみられるのか確認した

　その方法を以下に示す

　実験で使用する菌液(yaiA-GFP on pSB6)を用意した

[吸光度の測定]

　菌液がO.D.600＝0.3~0.4になるようにLB培地(+amp)を加え、調整した

　↓目的の濁度に到達した菌液を短時間37℃で振とう培養し、O.D.600≒0.5にした

　↓※以降菌液は氷上で操作した

　↓菌液2mLを分注し、これにそれぞれ終濃度が1mM,1μM,1nMになるようにH₂O₂を付加した

　↓37℃,30min.で振とう培養した。

　↓GFPイルミネーターを使用し、各濃度の蛍光の具合について確認した

終濃度	Negative control	1mM	1μM	1nM
加えたH₂O₂	-	1M H₂O₂…2μL	1mM H₂O₂…2μL	1μM H₂O₂…2μL

【実験結果】

(1)　RFP,GFP(acrAB),GFP(dps)の吸光度測定の結果を以下に示す

[Ⅰ]

	RFP (×1/100)	GFP(acrAB) (×1/100)	GFP(dps) (×1/100)
吸光度	0.0184	0.0194	0.0032
DNA濃度	92ng/μL	97ng/μL	16ng/μL
全量	29μL	29μL	29μL

[Ⅱ]

	RFP1 (×1/100)	RFP2 (×1/200)	GFP(acrAB)1 (×1/200)	GFP(acrAB)2 (×1/200)	GFP(dps)1 (×1/100)	GFP(dps)2 (×1/100)	RFP3 (×1/200)	RFP4 (×1/200)
吸光度	0.1514	0.633	0.7984	0.6255	0.7554	0.5416	0.792	0.779
DNA濃度	757ng/μL	6,330ng/μL	7,984ng/μL	6,255ng/μL	3,777ng/μL	2708ng/μL	7,920ng/μL	7,790ng/μL
全量	28μL	29μL	29μL	29μL	29μL	29μL	29μL	29μL

(2)　電気泳動の結果

OxyRのバンドが見られなかった

ゲル抽出の結果を以下に示す

pSB1C3(1/20)	E0240(1/20)	AcrAB(1/20)
OD260	0.094	0.014	0.028
DNA濃度(ng/μL)	94	14	28
全量(μL)	32	32	32

トランスフォーメイションの結果を以下に示す

AcrAB以外のプレートからはコロニーが見られなかった

(3)　PCR後に測定した吸光度の値を以下にまとめた

	OxyR	SufA	SodA	ahpC
吸光度	0.0646	0.0464	0.0534	0.0468
DNA濃度	323ng/μL	232ng/μL	267ng/μL	234ng/μL
全量	49μL	49μL	49μL	49μL

(4)　菌液を10倍希釈したときyaiAの濁度の平均は0.652だったので、1.5倍に希釈して濁度を測った

この値が0.464であったので15分間培養したところ吸光度が0.7908になったため2倍に希釈して3分間培養し、

このときの吸光度が0.490であったので、これを氷上で使用し実験を行った

測定した濁度
	yaiA(10倍希釈)	yaiA(15倍希釈)	yaiA(30倍希釈)
1	0.660	0.466	0.796
2	0.662	0.462	0.798
3	0.652	0.462	0.784
4	0.656	0.466	0.790
5	0.658	0.464	0.786
Average	0.6518	0.464	0.7908

Negative controlとH₂O₂を付加したもの各3種をGFPのイルミネーターにより肉眼で確認したところ、

少しNegative controlの方が暗いような印象はあったが、明瞭に光度が違うとは言えない状況であった

【考察】

(1)　カラム不使用のアルカリミニプレップのほうが比較的収率が良い結果となった

RFP1のDNA濃度が著しく低かったのは、操作中にDNAを吸ってしまったなど実験上の操作ミスの可能性が考えられる

(2)　OxyRのバンドが見られなかったのは青ゲルを使ったためバンドが良く見られなかったことが一因であると考えられる

pSB1C3のゲル抽の結果はあまりよくなかった

これはQGを加えてゲルを溶かした溶液の色が紫色であったため、

キアゲンのキットの取り扱い方に従ってCH₃COONa 30μLを加えてpH調整を試みたが、溶液の色に変化はなかった

結果から考えて溶液の紫色は青ゲルが原因であったと考えられる

またpH調整を試みたことによってDNAがいくらかロスされたと思われる

AcrAB以外のプレートからコロニーが得られなかったのは、ゲル抽出後の吸光度は確認されたので、

ライゲーションにおいてプラスミドを精製することができなかったためと考えられる

(3)　結果よりDNA濃度が十分であるので、PCRに成功したといえる

(4)　蛍光強度を測る吸光度系のセルが届き次第そちらで同様の実験をし、

数値としてのGFP光度の違いを測定しようと思う

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