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September 12

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Time

10：00～

Member

古道、竹内、革島

Furumichi,Takeuchi,Kawashima

Purpose

(1)　一晩37℃振とう培養したpSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)のアルカリミニプレップ、濃度測定　[古道]

(2)　一晩制限酵素処理したinverted LacZ 1,2、pSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、

pSB6A1-J04450(RFPプロモーターあり)、プロモーターレスLacZのDNA抽出　[古道]

(3)　CFP on pSB6(lowcopy vecter)、YFP on pSB6(lowcopy vecter)に

ライゲーション済の各プロモーター(dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA)のピックアップ　[古道]

(4)　E0240,K121013,TetR,AcrAB,dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA,yaiAの培養　[革島]

Method

(1)　一晩37℃振とう培養したpSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)のアルカリミニプレップ、濃度測定

　遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓吸光度測定(100倍希釈)した

(2)　一晩制限酵素処理したinverted LacZ 1,2、pSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、

pSB6A1-J04450(RFPプロモーターあり)、プロモーターレスLacZのDNA抽出

　一晩制限酵素処理したpSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、

　pSB6A1-J04450(RFPプロモーターあり)にCIAPを3µl加え、37℃で30分間インキュベートした

　↓アルカリフォスファターゼ処理し終えたpSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、

　　pSB6A1-J04450　　(RFPプロモーターあり)と一晩制限酵素処理したinverted LacZ 1,2、

　　プロモーターレスLacZを1％青ゲルに流し50Vで60分間電気泳動した

　↓ゲルの切り出しができそうなinverted LacZ 2とプロモーターレスLacZのゲルを切り出した

　↓切りだしたゲルの重さを事前に量った

　↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート

　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH₂Oを37μL加えた

　↓cfg.10,000rpm-1min

　↓保存

(3)　CFP on pSB6(lowcopy vecter)、YFP on pSB6(lowcopy vecter)に

ライゲーション済の各プロモーター(dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA)のピックアップ

　以下のUVに照らして光っていたコロニーと光っていなかったコロニーもピックアップし、

　アンピシリン入りのLBプレートにストリークした

　　　dps(YFP)

　　　ahp(CFP,YFP)

　　OxyR(CFP,YFP)

　　　SufA(CFP)

　　　SodA(CFP)

　↓37℃、一晩インキュベートした

(4)　E0240,K121013,TetR,AcrAB,dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA,yaiAの培養

　E0240,K121013,TetR,AcrAB,dps,ahpC,OxyR,SufA,SodA,yaiAの培養

　3μLのLB培地のはいった、オートクレーブ済みの試験官に3μLずつamp50mL/mgを加えた

　↓E0240,K121013,TetR,AcrAB,dps,ahpC,SufA,SodA,yaiAをそれぞれ2本ずつ試験官に植菌した

　　OxyRは4本植菌した

　↓over nightでインキュベート

Results

(1)　吸光度測定結果を以下に示した

吸光度測定(100倍希釈)
	0.023
	0.021
	0.011
	0.012
	0.017
	0.012
	0.017
	0.019
平均	0.017
濃度	0.017×100×50＝85(µl/ml)

(2)　ゲル抽出したinverted LacZ 1,2、pSB6A1-I13522(RFPプロモーターレス)、

pSB6A1-J04450(RFPプロモーターあり)、プロモーターレスLacZらを次回吸光度測定しDNA濃度を求める

その結果DNA濃度は薄く実験に使用できる濃度に満たなかった

(3)　ストリークしたdps(YFP)、ahp(CFP,YFP)、OxyR(CFP,YFP)、SufA(CFP)、SodA(CFP)は

次の日にすべて生えていたのが確認できた

(4)　全て生えていた

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【時間】

9:00～

【実験担当】

臼井,革島,竹内,中村,吉村

【実験目的】

(1)　カラム使用アルカリミニプレップとカラム不使用アルカリミニプレップの比較実験

(2)　ゲル作成→エタ沈→ゲル抽→吸光度→ライゲーション→トランスフォーメーション

(3)　本部提出用のSodA,sufA,ahpC,OxyRのPCRと制限酵素処理

(4)　過酸化水素濃度比較実験

【実験内容】

(1)　カラム使用アルカリミニプレップとカラム不使用アルカリミニプレップの比較実験

　RFP(promoterless, on pSB6A1)を試験管6本

　GFP(AcrAB, on pSB6A1)を試験管に4本

　GFP(dps, on pSB6A1)を試験管に4本

　それぞれ37℃のインキュベーターに3時間入れて振とう培養した

　↓培養後、半分をカラム不使用のアルカリミニプレップで処理し、

　　半分をカラムを使用したアルカリミニプレップで処理した

　カラム不使用のアルカリミニプレップで処理したものをⅠ、

　カラムを使用したアルカリミニプレップで処理したものをⅡとして実験手順をを以下に示す

[Ⅰ]

　培養した大腸菌を1.5mlエッペンに移し、25℃、15,000rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓Solution１を250μl加え、ピペッティング、ボルテックスした

　↓Solution２を250μl加え、4~5回上下して混ぜた

　↓Solution３を350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに流した

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を捨てた

　↓Solution４を500μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を捨てた

　↓Solution５を700μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を捨て、もう一度25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を捨て、チューブを蓋を切り取ったエッペンに取りかえた

　↓Milli Qを100μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓カラムを捨て、エッペンにイソプロパノール 800μl,CH₃COONa 50μlを加えた

　↓25℃、13,000rpmで10分間遠心した

　↓上層を捨て、70％エタノールをエッペンの8割程まで加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清を捨てた

　↓遠心乾燥器にかけた

　↓TEを30μl加えた

　↓これにより得られたサンプルの吸光度を測定した

[Ⅱ]

　菌液を1.5mLエッペンにデカンテーションで移した

　↓4℃、6,000rpmで2分間遠心した

　↓上清を捨てた

　↓この操作を菌液がすべてなくなるまで繰り返した

　↓SolutionⅠ100μLを加え、vortexにより撹拌

　↓常温で5分間放置した

　↓SolutionⅡ200μLを加え、上下に転倒させた

　↓氷上で5分間放置した

　↓SolutionⅢ150μLを加え、vortexにより撹拌した

　↓氷上で5分間放置した

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上清を新しい1.5mLエッペンに移し、ΦOH/CIAA200μLを加えてvortexにより撹拌した

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上部の水層を新しい1.5mLエッペンに移した

　↓100%EtOH 1mLを加え、上下に転倒した

　↓常温で10分間放置した

　↓4℃、15,000rpmで12分間遠心した

　↓上層を取り除いた

　↓70%EtOH 500μLを加えた

　↓4℃、15,000rpmで3分間遠心した

　↓EtOHを除いた

　↓2分間遠心乾燥した

　↓滅菌水30μLに溶かした

　↓これにより得られたサンプルの吸光度を測定した

(2)　ゲル作成→エタ沈→ゲル抽→吸光度→ライゲーション→トランスフォーメーション

右表に従い試薬を加え、これを4℃で30分間放置した
↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した
↓上清を取り除いた
↓70%EtOH 100μLを加えた
↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
↓上清を取り除いた
↓2分間乾燥させた(pSB1C3は追加でさらに4分間乾燥した)
↓MilliQ 30μLを加えた
↓それぞれにOrange Loadong Dye 6μLを加えた
↓1kbpマーカーとともに50Vで60分間電気泳動を行った
↓ゲルの切り出、その重さを量った
↓ゲルの三倍量のBuffer QGを加え、50℃で10分間インキュベートした
　(インキュベートの間は2、3分毎に振り混ぜた)
↓pSB1C3のみにCH₃COONaを3μL加えた
↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH₂Oを37μL加えた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓得られた溶液の内5μLを濃度測定に使用した

　(H₂Oを95μL加え20倍希釈とした)

	DNA	CH₃COONa	95%EtOH	計
pSB1C3	100	10	330	440
AcrAB	150	15	330	495
E0240	150	15	330	495
OxyR	150	15	330	495

E0240(ハイコピーベクター)、各種プロモーターのLigationを以下の手順で行った

　　　insert:vector=1:2

　下表1～3に従い試薬を調整した

　↓これらを16℃のウォーターバスに30分間つけた

　↓LigationしたsufA,ahpC,SodA(E0240)全量にDH5αを50μL加え3分間氷上に置いた

　↓43℃で3分間ヒートショックを与えた

　↓10分間氷上に置いた

　↓SOC培地0.9mlを加え、37℃で30分間回復培養を行った

　↓これをプレートにまき、37℃で培一晩養した

1.SufA
Insert(SufA)	0.87μl
Vevtor(E0240)	5μl
MilliQ	4.13μl
Ligation Mix	10μL
Total	20μl

2.ahpC
Insert(ahpC)	0.85μl
Vevtor(E0240)	5μl
MilliQ	4.25μl
Ligation Mix	10μL
Total	20μL

3.SodA
Insert(SodA)	2.01μl
Vevtor(E0240)	5μl
MilliQ	2.99μl
Ligation Mix	10μL
Total	20μl

(3)　本部提出用のSodA,sufA,ahpC,OxyRのPCRと制限酵素処理

　以下の組成とプログラムでSodA,sufA,ahpC,OxyRの各プロモーターについて2本ずつPCR処理を行った

プライマー(PM) (SodA,sufA,ahpC,OxyR)	0.75ul
テンプレートDNA	0.25ul
MgSO₄	2ul
dNTP	2.5ul
KODplus	0.5ul
Buffer	2.5ul
MilliQ	16.5ul
Total	25ul

Pre Denature	Denature	Annealing	Extention	+Extention
94℃	94℃	60℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	1min	2min	保持
	35サイクル

PCRの後に吸光度を測り、濃度を求めた(実験結果に詳細を示す)
次に右表の組成で制限酵素処理を行った
↓37℃でインキュベートを行った

＜組成＞
DNA	49μl
EcoRⅠ	1μl
PstⅠ	1μl
H Buffer	6μl
Milli Q	3μl
Total	60μl

(4)　過酸化水素(H₂O₂)の付加実験

　実際にH₂O₂を加え、H₂O₂応答性プロモーターを挿入したpSB6を培養した場合に、

　目で見ただけでGFPの蛍光強度の変化がみられるのか確認した

　その方法を以下に示す

　実験で使用する菌液(yaiA-GFP on pSB6)を用意した

[吸光度の測定]

　菌液がO.D.600＝0.3~0.4になるようにLB培地(+amp)を加え、調整した

　↓目的の濁度に到達した菌液を短時間37℃で振とう培養し、O.D.600≒0.5にした

　↓※以降菌液は氷上で操作した

　↓菌液2mLを分注し、これにそれぞれ終濃度が1mM,1μM,1nMになるようにH₂O₂を付加した

　↓37℃,30min.で振とう培養した。

　↓GFPイルミネーターを使用し、各濃度の蛍光の具合について確認した

終濃度	Negative control	1mM	1μM	1nM
加えたH₂O₂	-	1M H₂O₂…2μL	1mM H₂O₂…2μL	1μM H₂O₂…2μL

【実験結果】

(1)　RFP,GFP(acrAB),GFP(dps)の吸光度測定の結果を以下に示す

[Ⅰ]

	RFP (×1/100)	GFP(acrAB) (×1/100)	GFP(dps) (×1/100)
吸光度	0.0184	0.0194	0.0032
DNA濃度	92ng/μL	97ng/μL	16ng/μL
全量	29μL	29μL	29μL

[Ⅱ]

	RFP1 (×1/100)	RFP2 (×1/200)	GFP(acrAB)1 (×1/200)	GFP(acrAB)2 (×1/200)	GFP(dps)1 (×1/100)	GFP(dps)2 (×1/100)	RFP3 (×1/200)	RFP4 (×1/200)
吸光度	0.1514	0.633	0.7984	0.6255	0.7554	0.5416	0.792	0.779
DNA濃度	757ng/μL	6,330ng/μL	7,984ng/μL	6,255ng/μL	3,777ng/μL	2708ng/μL	7,920ng/μL	7,790ng/μL
全量	28μL	29μL	29μL	29μL	29μL	29μL	29μL	29μL

(2)　電気泳動の結果

OxyRのバンドが見られなかった

ゲル抽出の結果を以下に示す

pSB1C3(1/20)	E0240(1/20)	AcrAB(1/20)
OD260	0.094	0.014	0.028
DNA濃度(ng/μL)	94	14	28
全量(μL)	32	32	32

トランスフォーメイションの結果を以下に示す

AcrAB以外のプレートからはコロニーが見られなかった

(3)　PCR後に測定した吸光度の値を以下にまとめた

	OxyR	SufA	SodA	ahpC
吸光度	0.0646	0.0464	0.0534	0.0468
DNA濃度	323ng/μL	232ng/μL	267ng/μL	234ng/μL
全量	49μL	49μL	49μL	49μL

(4)　菌液を10倍希釈したときyaiAの濁度の平均は0.652だったので、1.5倍に希釈して濁度を測った

この値が0.464であったので15分間培養したところ吸光度が0.7908になったため2倍に希釈して3分間培養し、

このときの吸光度が0.490であったので、これを氷上で使用し実験を行った

測定した濁度
	yaiA(10倍希釈)	yaiA(15倍希釈)	yaiA(30倍希釈)
1	0.660	0.466	0.796
2	0.662	0.462	0.798
3	0.652	0.462	0.784
4	0.656	0.466	0.790
5	0.658	0.464	0.786
Average	0.6518	0.464	0.7908

Negative controlとH₂O₂を付加したもの各3種をGFPのイルミネーターにより肉眼で確認したところ、

少しNegative controlの方が暗いような印象はあったが、明瞭に光度が違うとは言えない状況であった

【考察】

(1)　カラム不使用のアルカリミニプレップのほうが比較的収率が良い結果となった

RFP1のDNA濃度が著しく低かったのは、操作中にDNAを吸ってしまったなど実験上の操作ミスの可能性が考えられる

(2)　OxyRのバンドが見られなかったのは青ゲルを使ったためバンドが良く見られなかったことが一因であると考えられる

pSB1C3のゲル抽の結果はあまりよくなかった

これはQGを加えてゲルを溶かした溶液の色が紫色であったため、

キアゲンのキットの取り扱い方に従ってCH₃COONa 30μLを加えてpH調整を試みたが、溶液の色に変化はなかった

結果から考えて溶液の紫色は青ゲルが原因であったと考えられる

またpH調整を試みたことによってDNAがいくらかロスされたと思われる

AcrAB以外のプレートからコロニーが得られなかったのは、ゲル抽出後の吸光度は確認されたので、

ライゲーションにおいてプラスミドを精製することができなかったためと考えられる

(3)　結果よりDNA濃度が十分であるので、PCRに成功したといえる

(4)　蛍光強度を測る吸光度系のセルが届き次第そちらで同様の実験をし、

数値としてのGFP光度の違いを測定しようと思う

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