Template:KIT-Kyoto-Augsut25

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August 25

Time

9:00～21:00

Member

岩城,古道,竹内,吉村
Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Yoshimura

Purpose

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる(3日目)　[吉村]
(2)　大腸菌の生存曲線を調べる(1日目)　[吉村]
(3)　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)のプレカルチャー　[古道]
(4)　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420)をDH5αに形質転換　[古道]
(5)　dps,AcrAB-pSB6A1(K121013)のLigation
(6)　pSB3K3(J04450),pSB6A1(K121013),pSB1A2(E0240),
pSB1AK3(I732950),pSB4A5(K193602)のプラスミド抽出

Method

(1)　大腸菌の生存曲線を調べる
　プレートにコロニーが生えているか確認し、コロニーの数を数えた
(2)　過酸化水素の浸透性を利用し、大腸菌の生存曲線を調べる
　実験(1)でcontrolのプレートにコロニーが生えなかったので、違った方法でプレートを作成した
　DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで培養した
　↓培養後、LB1mlに対して、培養液を1ml加えて希釈した
　↓希釈した培養液10μlをLBプレートにまき、37℃で1時間インキュベートした
　↓1時間後、過酸化水素水をLBプレートの中心に20μl滴下し、
　　滴下した過酸化水素水がLBプレートに完全に浸透するまで待った
　↓完全に浸透したのを確認し、37℃でインキュベートした(overnight)
(3)　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)のプレカルチャー
　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430),pSB1A2(J22005)の
　コロニーをピックアップしLB液体培地(+amp)に入れた
　↓37℃で振とう培養した
(4)　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420),をDH5αに形質転換
　pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0420)をそれぞれ1µl取り、そこにDH5α 100µlを加え混ぜた
　↓氷上、30min
　↓42℃で45秒間、熱ショックを与えた
　↓氷上、2min
　↓SOC培地0.9mlを加えた
　↓37℃で1時間振とう培養した
　↓400µlずつLB(+amp)プレートに播いて37℃でインキュベートした(overnight)
(5)　dps,AcrAB-pSB6A1(K121013)のLigation

EcoRⅠ-SpeⅠで制限酵素処理したdps,AcrABと
EcoRⅠ-XbaⅠで制限酵素処理したpSB6A1(K121013)に電気泳動を行い、
ゲル抽出、ライゲーションを行った

dpsは前日(24日)に制限酵素処理したものを用いた
↓pSB6A1(K121013)の制限酵素処理を行った
↓右表に従い試薬を混合し、37℃で30分間インキュベートした
↓CIAP 1μLを加えて、37℃で30分間インキュベートした
↓dpsとpSB6A1(K121013)それぞれにOrange Loading Dyeを10μLずつ加え、
　30μずつ、レーンにアプライした

↓ゲルのレーンには左2列にpSB6A1(K121013)を、右2列にdpsを流した
＜試薬組成＞
DNAsol30μL
M buffer5μL
EcoRⅠ1μL
XbaⅠ1μL
H2O13μL
全量50μL
(6)　大量培養後のアルカリミニプレップ
　以下の5種類のベクターを用意した
　　　　pSB3K3(J04450)
　　　　pSB6A1(K121013)
　　　　pSB1A2(E0240)
　　　　pSB1AK3(I732950)
　　　　pSB4A5(K193602)
　菌液をチューブに入る量だけ入れた
　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
　↓上清を捨てた後、菌液を更に追加した
　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
　↓以上の操作を菌液がなくなるまで繰り返した
　↓solⅠ 4mLを加え、vortexした
　↓solⅡ 200μLを加えon ice 5min.
　↓solⅢを150μL加えon ice 5min.
　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
　↓イソプロパノール400μL(等量)を加えた
　↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した
　↓70%EtOHを200μL加えた
　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
　↓遠心乾燥を行った
　↓これをTE(RNase)30μLに溶解し、冷蔵保存した
Results
(1)　コロニー数を数えて以下の表にまとめた
H2O2濃度0mM(control)100nM10nM1nM100pM10pM1pM
コロニー数07147590144289
controlのプレートになぜかコロニーが生えなかった
この実験では大腸菌をプレートにまく作業を７回繰り返したため、時間差が生じてしまったのが原因とみられる
とにかくcontrolプレートに大腸菌が生えなければどうしようもないので、この結果は不採用とした
(2)　8月26日に結果を記載した
(3)　三本ともプレカルチャーが成功したため、8月27日の実験で使用した
(4)　pSB1A2(I13507) ,pSB1A2(E0420)のトランスフォーメーションは成功した
よって、8月27日の実験で使用することになった
(5)　ゲル抽出に移る前にdpsのバンドが十分量検出できなかったため、
ゲル抽出、およびLigationを行うことができなかった
pSB6A1(K121013)のバンドははっきりと見えたが、濃度としては不十分だった
(6)　すべてのプラスミドの濃度が低かった
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