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From 2010.igem.org

August 29

【時間】

9:00～

【実験担当】

岩城,古道,竹内,中村,臼井

【実験目的】

(1)　pSB6A1(BBa_K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定

(2)　hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR

【実験内容】

(1)　pSB6A1(BBa_K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定

　前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに８割ほど移した

　↓遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心５分（20℃、14500rpm）

　↓上清をカラムに加えた

　↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓20℃、14500rpmで1分間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心３０秒（20℃、14500rpm）

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓20℃、14500rpmで30秒間遠心を行った

　↓溶出液を回収

　↓電気泳動を行い、同時に260nmの波長で吸光度測定を行った

(2)　hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR

　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を

　Mixしたプライマー(hemH,ahpC,dps,OxyR)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた

　↓それぞれのエッペンに下に示した組成で溶液を加えた

　↓下に示したプログラムでPCR反応を行った

　↓PCR産物を電気泳動にかけた

テンプレートDNA	各0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-	5μL
2mM d NTPs	5μL
2mM MgSO₄	4μL
MilliQ	33μL
KOD-Plus-	1μL

(ahpC,OxyR) 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 62.2℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min 保持 30サイクル

(hemH,dps) 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 33sec 2min 保持 30サイクル

【実験結果】

(1)

吸光度測定結果 0.059 0.055 0.062 0.059 0.070 平均 0.061

この値から計算して、 DNA濃度：0.061×100×50＝3.05×10²(μg/ml) 電気泳動の結果、きちんとバンドが検出された

(2)　PCR産物の電気泳動の結果、増幅に成功した