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Contents

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September 14

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September 15

【時間】

9:00～

【実験担当】

臼井,革島,竹内,中村,吉村

【実験目的】

(1)　カラム使用アルカリミニプレップとカラム不使用アルカリミニプレップの比較実験
(2)　ゲル作成→エタ沈→ゲル抽→吸光度→ライゲーション→トランスフォーメーション
(3)　本部提出用のSodA,sufA,ahpC,OxyRのPCRと制限酵素処理
(4)　過酸化水素濃度比較実験

【実験内容】

(1)　カラム使用アルカリミニプレップとカラム不使用アルカリミニプレップの比較実験
　RFP(promoterless, on pSB6A1)を試験管6本
　GFP(AcrAB, on pSB6A1)を試験管に4本
　GFP(dps, on pSB6A1)を試験管に4本
　それぞれ37℃のインキュベーターに3時間入れて振とう培養した
　↓培養後、半分をカラム不使用のアルカリミニプレップで処理し、
　　半分をカラムを使用したアルカリミニプレップで処理した
　カラム不使用のアルカリミニプレップで処理したものをⅠ、
　カラムを使用したアルカリミニプレップで処理したものをⅡとして実験手順をを以下に示す
[Ⅰ]
　培養した大腸菌を1.5mlエッペンに移し、25℃、15,000rpmで1分間遠心して集菌した
　↓上清を捨てた
　↓Solution１を250μl加え、ピペッティング、ボルテックスした
　↓Solution２を250μl加え、4~5回上下して混ぜた
　↓Solution３を350μl加えた
　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
　↓上清をカラムに流した
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓溶出液を捨てた
　↓Solution４を500μl加えた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓溶出液を捨てた
　↓Solution５を700μl加えた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓溶出液を捨て、もう一度25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓溶出液を捨て、チューブを蓋を切り取ったエッペンに取りかえた
　↓Milli Qを100μl加えた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓カラムを捨て、エッペンにイソプロパノール 800μl,CH3COONa 50μlを加えた
　↓25℃、13,000rpmで10分間遠心した
　↓上層を捨て、70％エタノールをエッペンの8割程まで加えた
　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
　↓上清を捨てた
　↓遠心乾燥器にかけた
　↓TEを30μl加えた
　↓これにより得られたサンプルの吸光度を測定した
[Ⅱ]
　菌液を1.5mLエッペンにデカンテーションで移した
　↓4℃、6,000rpmで2分間遠心した
　↓上清を捨てた
　↓この操作を菌液がすべてなくなるまで繰り返した
　↓SolutionⅠ100μLを加え、vortexにより撹拌
　↓常温で5分間放置した
　↓SolutionⅡ200μLを加え、上下に転倒させた
　↓氷上で5分間放置した
　↓SolutionⅢ150μLを加え、vortexにより撹拌した
　↓氷上で5分間放置した
　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
　↓上清を新しい1.5mLエッペンに移し、ΦOH/CIAA200μLを加えてvortexにより撹拌した
　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
　↓上部の水層を新しい1.5mLエッペンに移した
　↓100%EtOH 1mLを加え、上下に転倒した
　↓常温で10分間放置した
　↓4℃、15,000rpmで12分間遠心した
　↓上層を取り除いた
　↓70%EtOH 500μLを加えた
　↓4℃、15,000rpmで3分間遠心した
　↓EtOHを除いた
　↓2分間遠心乾燥した
　↓滅菌水30μLに溶かした
　↓これにより得られたサンプルの吸光度を測定した
(2)　ゲル作成→エタ沈→ゲル抽→吸光度→ライゲーション→トランスフォーメーション

右表に従い試薬を加え、これを4℃で30分間放置した
↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した
↓上清を取り除いた
↓70%EtOH 100μLを加えた
↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
↓上清を取り除いた
↓2分間乾燥させた(pSB1C3は追加でさらに4分間乾燥した)
↓MilliQ 30μLを加えた
↓それぞれにOrange Loadong Dye 6μLを加えた
↓1kbpマーカーとともに50Vで60分間電気泳動を行った
↓ゲルの切り出、その重さを量った
↓ゲルの三倍量のBuffer QGを加え、50℃で10分間インキュベートした
　(インキュベートの間は2、3分毎に振り混ぜた)
↓pSB1C3のみにCH3COONaを3μL加えた
↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた
↓10,000rpmで1分間遠心した
↓得られた溶液の内5μLを濃度測定に使用した

　(H2Oを95μL加え20倍希釈とした)
DNACH3COONa95%EtOH計
pSB1C310010330440
AcrAB15015330495
E024015015330495
OxyR15015330495
E0240(ハイコピーベクター)、各種プロモーターのLigationを以下の手順で行った
　　　insert:vector=1:2
　下表1～3に従い試薬を調整した
　↓これらを16℃のウォーターバスに30分間つけた
　↓LigationしたsufA,ahpC,SodA(E0240)全量にDH5αを50μL加え3分間氷上に置いた
　↓43℃で3分間ヒートショックを与えた
　↓10分間氷上に置いた
　↓SOC培地0.9mlを加え、37℃で30分間回復培養を行った
　↓これをプレートにまき、37℃で培一晩養した
1.SufA
Insert(SufA)0.87μl
Vevtor(E0240)5μl
MilliQ4.13μl
Ligation Mix10μL
Total20μl
2.ahpC
Insert(ahpC)0.85μl
Vevtor(E0240)5μl
MilliQ4.25μl
Ligation Mix10μL
Total20μL
3.SodA
Insert(SodA)2.01μl
Vevtor(E0240)5μl
MilliQ2.99μl
Ligation Mix10μL
Total20μl
(3)　本部提出用のSodA,sufA,ahpC,OxyRのPCRと制限酵素処理
　以下の組成とプログラムでSodA,sufA,ahpC,OxyRの各プロモーターについて2本ずつPCR処理を行った
プライマー(PM)
(SodA,sufA,ahpC,OxyR)		0.75ul
テンプレートDNA0.25ul
MgSO42ul
dNTP2.5ul
KODplus0.5ul
Buffer2.5ul
MilliQ16.5ul
Total25ul
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
94℃94℃60℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec1min2min保持
35サイクル
PCRの後に吸光度を測り、濃度を求めた(実験結果に詳細を示す)
次に右表の組成で制限酵素処理を行った
↓37℃でインキュベートを行った
＜組成＞
DNA49μl
EcoRⅠ1μl
PstⅠ1μl
H Buffer6μl
Milli Q3μl
Total60μl
(4)過酸化水素(H2O2)の付加実験 ＜目的＞ 実際にH2O2を加えH2O2応答性プロモーターを挿入したpSB6を培養した場合に目で見ただけでGFPの蛍光強度の変化がみられるのか確認する。 ＜方法＞ 実験で使用する菌液(yaiA-GFP on pSB6)を用意した。 ・吸光度の測定 菌液がO.D.600＝0.3~0.4になるようにLB培地(amp+)を加え、調整した。 ↓ O.D.600＝0.3~0.4になった菌液を短時間37℃で振とう培養しO.D.600＝約0.5にした。 ↓※以降菌液は氷上で操作 菌液2mLを分注し、これにそれぞれ終濃度が1mM,1μM,1nMになるようにH2O2を付加した。 Negative control 終濃度 1mM 終濃度1μM 終濃度1nM 培地に加えたH2O2 1M H2O2…2μL 1mM H2O2…2μL 1μM H2O2…2μL ↓ 37℃,30min.で振とう培養した。 ↓ GFPイルミネーターを使用し、各濃度の蛍光の具合について見た。 【実験結果】 (1) RFP、GFP（acrAB）、GFP（dps）の吸光度測定の結果を以下に示す。 (Ⅰ) RFP（×1/100） GFP（acrAB）（×1/100） GFP（dps）（×1/100） 吸光度 0.0184 0.0194 0.0032 DNA濃度 92ng/μL 97ng/μL 16ng/μL 全量 29μL 29μL 29μL (Ⅱ) RFP１（×1/100） RFP２（×1/200） GFP（acrAB）１（×1/200） GFP（acrAB）２（×1/200） GFP（dps）１（×1/100） GFP（dps）２（×1/100） 吸光度 　0.1514 　　0.633 　0.7984 　　0.6255 　0.7554 　　0.5416 DNA濃度 757ng/μL 6,330ng/μL 7,984ng/μL 6,255ng/μL 3,777ng/μL 2708ng/μL 全量 28μL 29μL 29μL 29μL 29μL 29μL RFP３（×1/200） RFP４（×1/200） 0.792 0.779 7,920ng/μL 7,790ng/μL 29μL 29μL (２)電気泳動の結果 電気泳動の結果 OxyRのバンドが見られなかった。 　ゲル抽の結果を以下に示す。 ｐSB1C3 (1/20) E0240 (1/20) AcrAB(1/20) OD260 0.094 0.014 0.028 DNA濃度(ng/μL) 94 14 28 全量(μL) 32 32 32 　トランスフォーメイションの結果。 AcrAB以外のプレートからはコロニーが見られなかった。 (３) OxyR SufA SodA ahpC 吸光度 0.0646 0.0464 0.0534 0.0468 DNA濃度 323ng/μL 232ng/μL 267ng/μL 234ng/μL 全量 49μL 49μL 49μL 49μL (4) 菌液を10倍希釈したときyaiAの吸光度の平均は0.652だったので、1.5倍に希釈して、吸光度を測った。この値が0.464であったので15min.培養したところ吸光度が0.7908になったため、2倍希釈し、3min.培養し、このときの吸光度が0.490であったので、これをon ice で使用し、実験を行った。 yaiA(10倍希釈)の吸光度　　　yaiA(15倍希釈)の吸光度 yaiA(30倍希釈)の吸光度 1,0.660 1,0.466 1,0.796 2,0.662 2,0.462 2,0.798 3,0.652 3,0.462 3,0.784 4,0.656 4,0.466 4,0.790 5,0.658 5,0.464 5,0.786 Ave,0.6518 Ave.0.464 Ave,0.7908 Negative controlとH2O2を付加したもの各3種をGFPのイルミネーターにより肉眼で確認したところ、少しNegative controlの方が暗いような印象はあったが、明瞭に光度が違うとは言えない状況であった。 【考察】 (1)カラム不使用のアルカリミニプレップのほうが比較的収率が良い結果となった RFP1のDNA濃度が著しく低かったのは、操作中にDNAを吸ってしまったなど実験上の操作ミスの可能性が考えられる (2) OxyRのバンドが見られなかったのは青ゲルを使ったためバンドが良く見られなかったことが一因であると考えられる。 ｐSB1C3のゲル抽の結果はあまりよくなかった。 これはQGを加えてゲルを溶かした溶液の色が紫色であったためキアゲンのキットの取り扱い方に従ってCH3COONa 30μLを加えてｐH調整を試みたが、溶液の色に変化はなかった。結果から考えて溶液の紫色は青ゲルが原因であったと考えられる。またｐH調整を試みたことによってDNAがいくらかロスされたのであろう。 AcrAB以外のプレートからはコロニーが見られなかったのは、ゲル抽後の吸光度は確認されたのでライゲーションにおいてプラスミドを精製することができなかったと考えられる。 (3)結果よりDNA濃度が十分であるので、PCRに成功したといえる。 (4)蛍光強度を測る吸光度系のセルが届き次第そちらで同様の実験をし、数値としてのGFP光度の違いを測定しようと思う。

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