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From 2010.igem.org

August 29

Time

9:00～

Member

岩城,古道,竹内,中村,臼井

Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura,Usui

Purpose

(1)　pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定　[古道]

(2)　hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR　[古道]

(3)　SufA,OxyRのPCRの電気泳動による確認　[岩城]

(4)　pSB6A1(K121013)のmidiprep　[竹内]

Method

(1)　pSB6A1(K121013)のアルカリミニプレップ、電気泳動、濃度測定

　前日から培養したE.coliを1.5mlエッペンに8割ほど移した

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心を行った

　↓溶出液を回収

　↓電気泳動を行い、同時に260nmの波長で吸光度測定を行った

(2)　hemH,ahpC,dps,OxyRのPCR

　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を

　Mixしたプライマー(hemH,ahpC,dps,OxyR)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた

　↓それぞれのエッペンに下に示した組成で溶液を加えた

　↓下に示したプログラムでPCR反応を行った

　↓PCR産物を電気泳動にかけた

テンプレートDNA	各0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-	5μL
2mM d NTPs	5μL
2mM MgSO4	4μL
MilliQ	33μL
KOD-Plus-	1μL

(ahpC,OxyR) 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 62.2℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min 保持 30サイクル

(hemH,dps) 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 33sec 2min 保持 30サイクル

(3)　SufA,OxyRのPCRの電気泳動による確認

　PCR産物5μlを使用して電気泳動を行った

　1%ゲルを用いて135V,15minの条件で泳動した

(4)　pSB6A1(K121013)のmidiprep

　カラム2本に各EQ1 10ml加え平衡化した

　前日から培養していたpSB6A1(K121013)100ml

　↓R3を4 ml加えてボルテックスした

　↓L7を4 ml加えて5 min放置した

　↓N3を4 ml加えた

　↓12,000rpm,10 min,25℃で遠心した

　↓上清を保存しそれをカラムの上に全量載せた

　↓カラムにW8を10 ml×2加え洗浄した

　↓カラムにE4を5 ml加えた

　↓チューブに2-プロパノールを3.5 ml加えた

　↓15,000rpm,30min,4℃で遠心した

　↓70 %エタノールを3 ml加えた

　↓15,000rpm,30 min,4 ℃で遠心した

　↓上清を捨て、37 ℃でインキュベート、乾燥させた

　↓TE50 μlに溶かし、溶け切るまで冷蔵した

Results

(1)

吸光度測定結果 0.059 0.055 0.062 0.059 0.070 平均 0.061

この値から計算して、 DNA濃度：0.061×100×50＝3.05×10²(μg/ml) 電気泳動の結果、きちんとバンドが検出された

(2)　PCR産物の電気泳動の結果、増幅に成功した

(3)　SufAに関しては全てのサンプルでバンドが検出できた

　OxyRに関しては1,2のサンプルはバンドが検出できたが、3,4では検出できなかったので破棄した

(4)　冷蔵庫で保管した