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Revision as of 02:28, 24 October 2010 by Matsubara3 (Talk | contribs)

Contents

September 26

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Time

9：00～

Member

福山,臼井,革島,中村
Fkuyama,Usui,Kawashima,Nakamura

Purpose

(1)　promoter less RFP、pSB1C3のミニプレ→制限酵素処理　[革島]
(2)　各プロモーター入GFP on pSB6A1の制限酵素処理　[中村]
(3)　pSB1C3のゲル抽出　[福山]
(4)　ahpC,sufAの蛍光強度測定実験　[臼井]

Method

(1)　promoter less RFP、pSB1C3のミニプレ→制限酵素処理
　＊ミニプレ
　　　9/15カラム不使用のミニプレ参照
　　　最後はRNase 20ng/μL入りMilliQ(50倍希釈) 30μLに溶かした
　＊制限酵素処理
　　　pSB1C3：DNA濃度10万ng分をEcoRⅠ、pstⅠ1μL用い、Total　25μLで処理した(8本)
　　　promoter less RFP：DNA濃度10万ng分をEcoRⅠ、XbaⅠ1μL用い、Total　25μLで処理した(3本)
(2)　各プロモーター入GFP on pSB6A1の制限酵素処理
　各プロモーター(acrAB、ahpC、dps、oxyR、sodA、sufA、yaiA)
　の入ったpSB6A1をE-Pcutした(Overnight)
</TR>
表1: 制限酵素処理試薬組成
acrABahpCdpsoxyRsodAsufAyaiA
DNAsol8.8μL5.5μL8.56μL7.1μL6.96μL8.7μL6.2μL
EcoRⅠ
1μL
PstⅠ
1μL
10xH
2.5μL
Milli Q
Final　25μLに調整
(3)　pSB1C3のゲル抽出
　4種類の濃度（3589.8ng/μlが1試料,2393.2ng/μlが3試料,1196.6ng/μlが2試料,598.3ng/μlが1試料）
　pSB1C3計7試料(全量はそれぞれ50 μl)に3 μlずつCIAPを加えた
　↓前日に作成した1％青ゲルを使って100Vで25分間電気泳動した
　　確認のため、同時に各試料5 μlずつとって1％アガロースゲルを使って135Vで15分間電気泳動した
　↓確認のための電気泳動でバンドが確認できたので、バンドが見えなかった青ゲルをさらにEtBrで20分間染色した
　↓UVを照射してバンドを確認できたので、ゲルを切り出した
　↓各バンドの試料につき400 μlずつMilliQを加えた
　↓フェノールを430 μlほど加えた
　↓遠心（13,000 rpm、5分間、25℃）
　↓上清を回収
　↓フェノールクロロフォルムをエッペンチューブの8割ほど加え、vortex
　↓遠心（13,000 rpm、5分間、25℃）
　↓上清を回収
　↓酢酸ナトリウムを50 μlずつ、イソプロパノールを800 μlずつ加えた
　↓遠心（14,500 rpm,30分間,4℃）
　↓上清を捨て、70％エタノールを500 μlずつ加えた
　↓遠心（14,500 rpm,30分間,4℃）
　↓上清を捨て、乾燥させた
　↓TEを11 μlずつ加えた
　↓冷凍庫で保存
(4)　ahpC,sufAの蛍光強度測定実験
　菌液濁度(O.D.600)を0.4~0.6に調整した
　↓終濃度がlessおよび1nM～1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した
　↓37℃でインキュベートし、10分ごとに菌液500μLずつ回収した
　↓cfg.4℃ 14,000rpm,1min
　↓上清を除いた
　↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した
　↓全量を蛍光強度測定に用いた
　　※この操作を80分まで行った

Results

(1)
表2: 濁度測定
RFP 1RFP 2RFP 3RFP 4RFP 5RFP 6RFP 7pSB1C3
OD2600.7530.5890.7560.5050.5030.5170.4560.570
DNA濃度1882514725188251262512591129251140014250
全量2829292929292929
(2)明日、ゲル抽予定
(3)吸光度をまだ測っていないので、ゲル抽出が上手くいったのかはわからない

Consideration

(1)　問題なく実験はうまくいった
(3)　今までも、青ゲルを使った抽出のための電気泳動で、バンドが見えないことがあったようだが、
今回のように EtBr染色し、UVにあてるとバンドの存在が確認できるケースも結構あったのかもしれない。
(4)　29日の実験ノートに結果を添付

September 27

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Time

9：00～

Member

岩城、福山、古道、臼井、革島、中村、吉村
Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura

Purpose

(1)　前日培養しておいた、dps＋GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFP, pSB1C3のミニプレップ　[古道]
(2)　(1)でミニプレップ処理をしたdps＋GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFPの制限酵素処理　[古道]
(3)　9月26日の(3)の続き　―　pSB1C3のゲル抽出後の吸光度測定　[福山]
(4)　acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA,sufA,yaiA(いずれもon GFP+pSB6A1),pSB1C3のゲル抽出　[福山]
(5)　ベクターpSB1C3,インサートSufA+GFP,OxyR,SodA,yaiAのライゲーションとトランスフォーメーション　[福山]
(6)　TetR,K121013の蛍光強度測定　[臼井、中村]

Method

(1)　前日培養しておいた、dps＋GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFP, pSB1C3のミニプレップ
　1.5mlエッペンチューブに集菌
　↓SolutionⅠを100µl加えボルテックスし常温で5分放置
　↓SolutionⅡを200µl加え混ぜ氷上に5分放置(これ以降はボルテックスをしない)
　↓SolutiionⅢを150µl加え混ぜ氷上に5分放置
　↓cfg　4℃、15,000rpm、5分
　↓上清を回収しそれに100％エタノールを1ml加え混ぜた
　↓常温10分放置
　↓cfg　4℃、15,000rpm、12分
　↓上清を捨て沈殿に70％エタノールを500μl加えた
　↓cfg　4℃、15,000rpm、3分
　↓エタノールを除き2分遠心乾燥させた
　↓RNase入りTEを30µl加え溶解した
　↓各吸光度を測定した
(2)　(1)でミニプレップ処理をしたdps＋GFP, ahpC+GFP, AcrAB+GFPの制限酵素処理
　以下の組成に従い制限酵素処理を行った
　↓37℃、一晩、インキュベートした
表1: 制限酵素処理
dpsAcrABahpC
DNA20μl20μl15µl
Buffer　H5µl5µl5µl
H2O23µl23µl28μl
XbaⅠ1µl1µl1µl
PstⅠ1µl1µl1µl
(3)　pSB1C3のゲル抽出後の吸光度測定
　9月26日の(3)で得たpSB1C3の7試料(各試料の全量11 μl)をそれぞれ1 μlとって100倍希釈で吸光度測定を行った
(4)　acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA,sufA,yaiA(いずれもon GFP+pSB6A1),pSB1C3のゲル抽出
　acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA,sufA,yaiA(いずれもon GFP+pSB6A1),pSB1C3それぞれに5倍希釈で
　Loading Bufferを加えた
　↓それぞれを低融点アガロース1%ゲルにアプライし、50Vで1時間電気泳動した
　↓UVを照射してバンドを確認できたので、ゲルを切り出した
　↓各バンドの試料につき400 μlずつMilliQを加えた
　↓フェノールを430 μlほど加えた
　↓遠心（13,000 rpm、5分間、25℃）
　↓上清を回収
　↓フェノールクロロフォルムをエッペンチューブの8割ほど加え、vortex
　↓遠心（13,000 rpm、5分間、25℃）
　↓上清を回収
　↓酢酸ナトリウムを50 μlずつ、イソプロパノールを800 μlずつ加えた
　↓遠心（14,500 rpm,30分間,4℃）
　↓上清を捨て、70％エタノールを500 μlずつ加えた
　↓遠心（14,500 rpm,30分間,4℃）
　↓上清を捨て、乾燥させた
　↓pSB1C3(*1)にTEを10 μl加えて溶かし、この溶液をSufAにいれて溶かした→溶液(*2)
　OxyRにTEを10 μl加えて溶かし、この溶液をpSB1C3(*2)にいれて溶かした→溶液(*3)


(5)　下表1の通りに溶液を調整した
　↓16℃で30分間インキュベートした
　↓各試料にDH5α懸濁液150 μlずつ加えた
　↓氷上で3分放置
　↓43℃下に30秒置いた
　↓soc培地を900 μlずつ加えた
　↓集菌してクロラムフェニコール入りのLB寒天培地にまいた
　↓37℃,overnightでインキュベート
表2: 試薬組成(単位は μl)
試料1試料2試料3試料4試料5
pSB1C3(*2)全量(*3)全量0.521
Suf+GFP(*2)全量0
OxyR(*3)全量3.9
yaiA5.6
SodA9
MilliQ5.62.4
2xLigation Mix1010101010
全量2020202020
(6)　TetR,K121013の蛍光強度測定
　菌液濁度(O.D.600)を0.4~0.6に調整した
　↓終濃度がlessおよび1nM～1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した
　↓37℃でインキュベート
　　※10分ごとに菌液500μLずつ回収した
　↓cfg.4℃ 14,000rpm 1min
　↓上清を除いた
　↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した
　↓全量を蛍光強度測定に用いた
　※この操作を90分まで行った

Results

(1)
表3: 吸光度結果
1/100dpsAcrABahpC
1回目1.2421.5702.616
2回目1.1731.5952.538
3回目1.1671.5162.531
4回目1.1681.3892.533
5回目1.1691.3942.512
平均 1.18381.49282.546
濃度5919(ng/µl)7464(ng /µl)12730(ng/µｌ)
(2)次回に正しくcutされているのかを電気泳動で確認する
(3)吸光度測定(260nm)の結果を表4に示した。
但し、試料8は１回測定した後、間違えて希釈した試料を捨ててしまった
また、前日の実験(3)では7つの試料であったが、
切り出したゲルを10個のエッペンに分けて入れたので、今回は試料数が10になっている
表4: 吸光度(1/100)
試料1試料2試料3試料4試料5試料6試料7試料8試料9試料10
1回目0.0240.0170.0090.05400.0590.0810.0060.0160.015
2回目0.0170.0210.0110.0560.0030.0670.0860.0130.007
3回目0.0170.0130.0120.0540.0060.060.0780.0150.012
4回目0.0170.0180.0130.0610.0040.0610.0780.0150.009
5回目0.0180.0140.0140.0600.0630.0830.0190.008
平均0.0190.01660.01180.0570.00260.0620.08120.0060.01560.0102
濃度(ng/μl)93835928513310406307851
(4)　acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodAを電気泳動したゲルを粉砕してしまったので、DNAのゲル抽出はできなかった
sufA,yaiA,pSB1C3に関してはDNAのゲル抽出ができた
吸光度測定(260nm)の結果を表に示した
表5: 吸光度測定結果(1/100)
SufApSB1C3
(EcoRⅠとPstⅠでcut)		yaiA
1回目0.0410.0340.07
2回目0.0390.0330.069
3回目0.040.0340.068
平均0.040.03440.069
濃度(ng/μl)200172345
(5)　明日、コロニーができているかを確認する
(6)　29日実験ノートに添付

Consideration

(3)　100倍希釈で吸光度が0.010より小さい値を示した試料5と試料8はとても薄く、
誤差の範囲(ゼロ補正に使ったMilliQでも出うる値)なので、使い物にはならないと思われる
(4)　低融点アガロースゲルは非常にもろく壊れやすいので、持ち運びに細心の注意が必要

September 28

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Time

9：00～

Member

福山、古道、吉村
Fukuyama,Furumichi,Yoshimura

Purpose

(1)　前日制限酵素処理したdps+GFP,AcrAB+GFP,ahpC+GFPのカットチェック　[古道]
(2)　sufAの制限酵素処理　[古道]
(3)　pSB6A1(プロモーターレス,RFP),OxyR,AcrABのゲルを使ったDNA抽出　[福山]
(4)　pSB6A1(AcrAB,GFP),pSB6A1(ahpc,GFP),pSB6A1(OxyR,GFP),pSB6A1(SodA,GFP),
pSB6A1 (SufA,GFP),pSB6A1 (yaiA,GFP),pSB6A1 (dps,GFP)のEcoRⅠとPstⅠを使った制限酵素処理　[福山]
(5)　DH5α: pSB1C3(OxyR),pSB1C3(SodA)のシングルコロニーのピックアップ　[福山]

Method

(1)　前日制限酵素処理したdps+GFP,AcrAB+GFP,ahpC+GFPのカットチェック
　前日制限酵素処理したdps+GFP,AcrAB+GFP,ahpC+GFPを電気泳動した
(2)　sufAの制限酵素処理
　12615(ng/μl)のsufAを以下の組成の通りに制限酵素処理をした
　↓37℃、一晩、インキュベートした
表1: 制限酵素処理
DNA10μl
Buffer H5μl
H2O8.5μl
EcoRⅠ1μl
SpeⅠ0.5μl
total25μl
(3)　pSB6A1(プロモーターレス,RFP),OxyR,AcrABのゲルを使ったDNA抽出
　EcoRⅠとXbaⅠで制限酵素処理をしたpSB6A1(プロモーターレス,RFP)がそれぞれ100 μg入っている
　6つの試料に、CIAPを3 μlずつ加え、37℃で30分置いた
　↓CIAP処理を終えたpSB6A1(プロモーターレス,RFP)、
　　EcoR１とSpe１で制限酵素処理をしたOxyRとAcrABを1％アガロースゲルを用いて、50Vで50分間電気泳動した
　↓EtBrで20分間染色
　↓UVを照射し、ゲルを切り出した(pSB6A1(プロモーターレス,RFP)は2つのエッペンチューブにわけて回収した
　↓MilliQをそれぞれ400 μl 加えた
　↓60℃に7分ほど置いて、ゲルを溶かした
　↓フェノールを、エッペンチューブに入っているゲルとMilliQの合計量ほど加え、かるく混ぜた
　↓25℃, 13000 rpm で5分間遠心した
　↓上清を回収し、フェノールクロロフォルムをエッペンチューブの8割ほど加え、ボルテックス
　↓25℃, 13000 rpm で5分間遠心した
　↓上清を回収した
　↓酢酸ナトリウムを50 μl、イソプロパノールを800 μl加え混ぜた
　↓4℃, 14500 rpm で10分間遠心した
　↓上清を捨て、70％エタノールを500 μl加えた
　↓4℃, 14500 rpm で5分間遠心した
　↓上清を捨てた
　↓乾燥させた
　↓pSB6A1(プロモーターレス,RFP)は、エッペンチューブ1本あたり11 μlのTEに溶かした
　　そのうちの1μlはMilliQで100倍希釈して、吸光度を測定したOxyRとAcrABはそれぞれ20 μlのTEに溶かした
(4)　EcoRⅠとPstⅠを使った制限酵素処理
　表2の通りにDNA溶液に制限酵素,バッファーとMilliQを加えて、それぞれ全量が25 μlになるようにした(DNAはそれぞれ約100 μgになっている)
　↓overnightで37℃に置いた
表2：制限酵素試薬組成
単位はμl試料1試料2試料3試料4試料5試料6試料7
AcrAB9
ahpc6
dps9
OxyR7
SodA7
SufA9
yaiA6
EcoRⅠ1111111
pstＩ1111111
buffer H2.52.52.52.52.52.52.5
Milli Q11.514.51.513.513.511.514.5
合計25252525252525
(5)　DH5α: pSB1C3(OxyR),pSB1C3(SodA)のシングルコロニーのピックアップ
　27日の実験(5)で行ったトランスフォーメーションの結果、
　DH5α: pSB1C3(OxyR)
　　　 　pSB1C3(SodA)
　のみコロニーが確認できたので、それぞれDH5α(pSB1C3(OxyR))は16個、
　DH5α(pSB1C3(SodA))は1個のコロニーをクロラムフェニコール入りのLB寒天培地にストリークし、37℃に置いた

Results

(1)　それぞれ検出されたバンドの大きさは以下に記した通りになった
　　　dps　　→　約4kbp,約3kbp,約2kbp
　　　AcrAB　→　約4kbp,約2kbp
　　　ahpC　 →　約2kbp,約1kbp
(2)　結果は次回DNA抽出し吸光度を測定した際に見る
(3)　ゲル抽出済pSB6A1(プロモーターレス,RFP)の吸光度結果(100倍希釈)
表3: 吸光度測定結果
1/100RFP(プロモーターレス)1RFP(プロモーターレス)2
1回目0.0060.013
2回目0.0080.008
3回目0.0060.010
4回目0.0070.008
5回目0.0080.010
平均0.0070.0098
濃度35(ng/μl)49(ng/μl)
DNA濃度は十分になかった
(4)　制限酵素を反応させるまでの作業であったので、特に結果として挙げられるものはなかった
(5)　ピックアップしたコロニーが、本当に正しくライゲーションできているのかわからない
少なくとも、明日確認した時、
ストリークしたDH5αの部分が赤紫色になっているものは制限酵素処理の時点で失敗しているものである

Consideration

(1)　dps ,AcrABに関してはDNAの大きさが理想と異なる
AcrABのDNAの長さは327bpと小さいものであるため今回の結果のような大きなDNAのバンドが検出されることはない
対しahpCは理想のDNAの大きさに近いものが検出されたためahpCは実験に使用可能のものといえる
(3)　DNA濃度が十分になかった理由としてはゲルの切り出しが甘かったためと思われる

September 29

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Time

9：00～

Member

福山、臼井、中村、吉村
Fukuyama,Usui,Nakamura,Yoshimura

Purpose

(1)　acrAB,oxyR,sufA(いずれもプロモーターのみ)
sufA,yaiA,acrAB,ahpC,dps,oxyR,sodA(on K121013)のゲルからのDNA抽出　[福山、吉村]
(2)　TetR,K121013の蛍光強度測定　[臼井、中村]
(3)　DH5α(pSB1C3(OxyR)),DH5α(pSB1C3(SodA)) のLB液体培地への植菌　[福山]
(4)　ライゲーション、トランスフォーメーション　[福山]
　ベクター：EcoRⅠとXbaⅠで切断したpSB6A1(プロモーターレス,RFP)
　インサート：EcoRⅠとSpeⅠで切断したOxyRとAcrAB

Method

(1)　ゲルからのDNA抽出
　平常通りゲル抽出をおこなったが、今回は低融点ゲルを用いず普通のアガロースゲルを用いてゲルの切り出しをした
　↓ゲルの重さを測り、ゲルの3倍量のBufferQGを入れた
　↓5分間50℃でヒートショック
　↓ゲルと等量のイソプロパノールを加え、カラムにアプライした
　↓10,000rpm,4℃で1分間遠心し、溶出液を捨てた
　↓500μlのBufferQGを加えた
　↓10,000rpm,4℃で1分間遠心し、溶出液を捨てた
　↓750μlのBufferPEを加えた
　↓10,000rpm,4℃で1分間遠心し、溶出液を捨てた
　↓もう一度10,000rpm,4℃で1分間遠心し、溶出液を捨てた
　↓カラムをエッペンに移し替え30μlのミリQを滴下した
　↓10,000rpm,4℃で1分間遠心した
(2)　TetR,K121013の蛍光強度測定
　菌液濁度(O.D.600)を0.4~0.6に調整した
　↓終濃度がlessおよび1nM～1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した
　↓37℃でインキュベート
　　※10分ごとに菌液500μLずつ回収した
　↓cfg.4℃,14000rpm,1min
　↓上清を除いた
　↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した
　↓全量を蛍光強度測定に用いた
　※この操作を90分まで行った
(3)　DH5α(pSB1C3(OxyR)),DH5α(pSB1C3(SodA)) のLB液体培地への植菌
　28日にクロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した
　DH5α(pSB1C3(OxyR))とDH5α(pSB1C3(SodA))をクロラムフェミコールが入った3 mlのLB液体培地3セット分それぞれ植菌した
(4)　ライゲーション、トランスフォーメーション
　表1の通りに試料1、試料2をつくった
　　　pSB6A1(プロモーターレス,RFP)　→　17.6 ng/μl
　　　AcrAB　→　61 ng/μl
　　　OxyR　→　39 ng/μl
　↓16℃に30分間置いた
　↓氷上に30分間置いた
　↓DH5αの懸濁液を100 μlずつ加えた
　↓氷上に30分間置いた
　↓42℃に45秒置いた
　↓氷上に2分間置いた
　↓SOC培地を900 μlずつ加えた
　↓37℃で1時間振とう培養した
　↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地にまいた
表1: 試薬組成(単位はμl)
試料1試料2
pSB6A1(プロモーターレス,RFP)97.8
AcrAB1
OxyR1.5
Milli Q0.7
2xLigation Mix1010
合計2020

Results

(1)　sufA,yaiA,acrAB,ahpC,dps,oxyR(on K121013)はバンドが見えなかった
sodA(on K121013)は予想された位置とは違う場所にバンドが出た
acrAB,oxyR,sufA(いずれもプロモーターのみ)は切り出しに成功した
acrAB,oxyR,sufAの濃度は以下の通り
　　＊acrAB……39ng/μl(全量28μl)
　　＊oxyR……61ng/μl(全量28μl)
　　＊sufA……54.5ng/μl(全量58μl)


(2)　ちょっと通りますよ。
(3)　今日は、培養できたかどうかまだ判断できなかった
(4)　成功していれば、明日コロニーが観察できると思われる

Consideration

(1)　バンドが見えなかったのはRNAが分解されていなかったためと思われる
これからはRNaseを入れた後に37℃のインキュベーターの中に30分間入れておくという操作が必要である
バンドが予想された位置に出なかった理由は不明

September 30

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October 1

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