Template:KIT-Kyoto-September3

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September 3

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Time

9:00~

Member

福山,足立,吉村
Fukuyama,Adachi,Yoshimura

Purpose

  1. DNA miniprep of pSB6A1(K121013) and digestion by restriction enzymes.[Yoshimura]
  2. pSB6A1(K121013) digestion by restriction enzymes.[Adachi]
  3. Agarose gel electrophoresis of pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507) and pSB6A1(K121013).[Fukuyama]
(1) pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理 [吉村]
(2) pSB6A1(K121013)の制限酵素処理 [足立]
(3) ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),
pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)の電気泳動 [福山]

Method

(1) pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理
 前日から培養していた大腸菌を1.5mlエッペンにうつした
 ↓15,000rpm,25℃で1分間遠心した(集菌)
 ↓上清を捨てた
 ↓SolutionⅠを250μl加え、ピペッティング、ボルテックスして沈殿を完全に溶かした
 ↓SolutionⅡを250μl加え、4~5回上下にして混ぜた(膜溶解)
 ↓1分間放置した
 ↓SolutionⅢを350μl加えた(タンパク質析出)
 ↓13,000rpm,25℃で5分間遠心した
 ↓上清をカラムに流した
 ↓13,000rpm,25℃で30秒間カラムごと遠心した
 ↓溶出液を捨てた
 ↓SolutionⅣを500μl加えた
 ↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した
 ↓溶出液を捨てた
 ↓SolutionⅤを700μl加えた
 ↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した
 ↓溶出液を捨て、もう一度13,000rpm,25℃で30秒間遠心した
 ↓溶出液を捨て、チューブを蓋を切り取ったエッペンに取りかえた
 ↓滅菌水を100μl加えた(DNA溶出)
 ↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心し、プラスミドを濃縮した
 ↓制限酵素処理を行うために吸光度を測った
  (値を右表1に示した)
 ↓右表に示した組成で制限酵素処理を行った
 ↓37℃で40分間インキュベートした
 ↓135Vで15分間電気泳動してカットチェックをおこなった
表1: 吸光度
×1/100 pSB6A1
1回目0.041
2回目0.047
3回目0.047
4回目0.050
5回目0.045
Ave.0.046
表2: 試薬組成
DNA10μl
EcoR0.3μl
Pst0.3μl
M Buffer6μl
Milli Q7.4μl
Total20μl
(2) pSB6A1(K121013)の制限酵素処理
 pSB6A1(BBa K121013)の制限酵素処理をするために吸光計によりOD260で濁度を測定した
 濁度の測定結果を右表3に示す
   表3: pSB6A1(BBa K121013)の100倍希釈したときの濁度
 表3より、DNA濃度:0.0108×100×50=0.54×102(μg/ml)と分かった
 これは制限酵素処理するのに濃度が低すぎるため、翌日濃縮することにした
表3: 濁度
×1/100 pSB6A1
1回目0.007
2回目0.015
3回目0.008
4回目0.012
5回目0.012
Ave.0.0108
(3) pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)の電気泳動
 ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)を
 それぞれ5μlとって1μlのloading dyeを加えた
 ↓1%アがロースゲルを用いて、1kbp ladderとともに100Vで3時間電気泳動した

Results

(1) バンドが出なかった
(2) pSB6A1(K121013)のDNA濃度が薄すぎたため、制限酵素処理ができなかった
(3) pSB1A2(E0420)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した 
pSB1A2(E0430)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した 
pSB1A2(I13507)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した 
pSB6A1(K121013)→バンドは確認できなかった


Consideration

(1) 試薬に問題ありか?
(3) pSB6A1(K121013)→非常に薄いDNA溶液であると思われる