Template:KIT-Kyoto-September2

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September 2

Time

9:00～

Member

岩城,福山,古道,足立

Purpose

(1)　pSB6A1(K121013)の濃縮と制限酵素処理
(2)　プロモーターDNAのみを得る
(3)　プロモーターDNAを精製する
(4)　制限酵素処理済のpSB6A1(K121013)、pSB1A2(E0420)
pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のDNA抽出をする

Method

(1)　pSB6A1(K121013)の濃縮と制限酵素処理
　pSB6A1(K121013)の2試料(試料A,B)のうち、
　試料Aの一部を右表1,2の通りに制限酵素処理して135Vで15分間電気泳動した
　↓試料A,Bに酢酸ナトリウム200μL、イソプロパノール400μL(等量)を加えた
　↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した
　↓70%EtOHを200μL加えた
　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
　↓遠心乾燥を行った
　↓これにMilliQ30μLを加えた
　↓表3の通りに各試薬を加えて37℃で3時間ほどインキュベートした
　　　　※試料Bはここまで(一晩インキュベート)
　↓CIAPを3μl加えて37℃で30分間インキュベートした　
　↓3-colors Indicatorを8μl加え、50Vで１時間電気泳動した
表1
DNA10μl
Buffer H2μl
EcoRⅠ0.3μl
PstⅠ0.3μl
MilliQ7.4μl
total20μl
表2
DNA10μl
MilliQ10μl
total20μl
表3
DNA溶液30μl
EcoRⅠ0.5μl
PstⅠ0.5μl
H Buffer4μl
MilliQ5μl
total40μl
(2)　プロモーター(hemH,AcrAB,yaiA,SodA)のゲル抽出
　Orange Loading Dyeを加え、青ゲルにapplyした
　↓1kbpマーカーとともに50Vで1時間電気泳動した
　↓バンドのある部分のゲルを切り出し、エッペンに入れた
　↓ゲルの3倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベートし、2,3分毎に振り混ぜた
　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
　↓cfg.10,000rpm-1min
　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた
　↓cfg.10,000rpm-1min
　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた
　↓cfg.10,000rpm-1min
　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを370μL加えた
　↓cfg.10,000rpm-1min
　↓溶出液を新しいエッペンチューブにうつした　　　
(3)　プロモーター(dps,SodA,yaiA,AcrAB,hemH,OxyR)のフェノクロ処理
＜材料＞
　PCR済みのプロモーター(dps,SodA,yaiA,AcrAB,hemH,OxyR)
　H2O
　フェノールクロロホルム
　2-プロパノール
　70%ethanol
＜方法＞
　PCR後のDNAを以下の量エッペンに取り、全量600μlになるようH2Oを加え調節した
　hemH,OxyRについては、前回DNA量200μlでGEL抽出を行なおうとした際バンドが薄く抽出できなかったため、
　他のプロモーターのDNA量よりも増やした
dpsSodAyaiAAcrABhemHOxyR
DNA(μl)200200200200400400
H2O(μl)400400400400200200
計(μl)600
　↓CH3COONa 50μlを各エッペンに加えた。
　↓フェノールクロロホルムをエッペンの8割ぐらいまで入れた
　↓2，3回振ったのち、白濁するまでvoltexをした
　↓cfg,14500rpm,5min,Tr(室温)
　↓上清を回収したのち、2-プロパノールをエッペンの8割ぐらいまで加えた
　↓cfg,14500rpm,10min,4℃
　↓上清を捨て、70%ethanolをエッペンの8割ぐらいまで加えた
　↓cfg,14500rpm,3min,4℃
　↓上清を捨てた
　↓遠心乾燥機でペレットが乾燥するまで待った
　↓RNase in TE(10mg/ml)を各エッペンに30μlずつ加えた
(4)　制限酵素処理済のpSB6A1(K121013)、pSB1A2(E0420)、
pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のDNA抽出
　一晩制限酵素処理したpSB6A1(K121013)にCIAPを3µl加え、37℃で30分間インキュベートした
　↓アルカリフォスファターゼ処理し終えたpSB6A1(K121013)とpSB1A2(E0420)、
　　pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)を1％青ゲルに流し135Vで15分間電気泳動した
　↓バンドが検出されゲルの切り出しができそうなpSB1A2(E0420)
　　pSB1A2(E0430)、pSB1A2(I13507)のゲルを切り出した
　↓切りだしたゲルの重さを事前に量った
　↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート
　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
　↓cfg.10,000rpm-1min
　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた
　↓cfg.10,000rpm-1min
　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた
　↓cfg.10,000rpm-1min
　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた
　↓cfg.10,000rpm-1min
　↓保存した

Results

(1)　カットチェックは問題なかったが、ゲル抽出のための電気泳動後、
2本みえるはずのバンドが何故か4本確認できた。おかしな結果がでた試料Aは廃棄することにした
(2)　本当は最後は37μlのMilliQを加えるはずが、誤って370μl加えてしまった
今日は吸光度を計測しなかったので、濃度はまだ分かっていない
(3)　各プロモーターDNAを精製することができた
(4)　電気泳動の結果、pSB6A1(K121013)にはバンドが現れずまたは薄すぎて見えなかったのか、
ゲル抽出をすることができなかった。そのためpSB6A1(K121013)の濃縮を行う必要があった
その濃縮を実験内容(1)で行った
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