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From 2010.igem.org

September 1

【時間】

9:00～

【実験担当】

古道

【実験目的】

(1)　pSB1A2(BBa_E0420:CFP)、pSB1A2(BBa_E0430:YFP)、

pSB1A2(BBa_I13507:RFP)、pSB6A1(BBa_K121013)のアルカリミニプレップ、DNA濃度測定

(2)　アルカリミニプレップ済の

pSB1A2(BBa_E0420:CFP)9/1付け、pSB1A2(BBa_E0430:YFP)9/1付け、

pSB1A2(BBa_I13507:RFP)9/1付け、pSB6A1(BBa_K121013)の制限酵素処理

【実験内容】

(1)　pSB1A2(BBa_E0420:CFP)、pSB1A2(BBa_E0430:YFP)、

pSB1A2(BBa_I13507:RFP)、pSB6A1(BBa_K121013)のアルカリミニプレップ、DNA濃度測定

　培養済のpSB1A2(BBa_E0420:CFP)、pSB1A2(BBa_E0430:YFP)、

　pSB1A2(BBa_I13507:RFP)、pSB6A1(BBa_K121013)を1.5mlエッペンに集菌した

　↓菌体を氷令したSoltionⅠ100µlに懸濁しvortexした

　↓SoltionⅡ200µl加え混合し氷上に5分放置した

　↓SoltionⅢ150µl加え混合し氷上に5分放置した

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓上清を回収しφOH/CIAAを200µl加え14000rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収しCIAA を200µl加え14000rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収し400µlのイソプロパノールを加え混ぜた

　↓4℃、14,000rpmで20分間遠心した

　↓上澄みを捨て70％エタノールを200µl加えvortexした

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓上澄みを捨てて5分間、37℃インキュベートで乾燥させた

　↓RNase入りTE(10µg/ml)30µlを加え37℃で30分間インキュベートした

　↓吸光度測定をした

　↓8/31にアルカリミニプレップ処理をしたpSB1A2(BBa_E0420:CFP)、

　　pSB1A2(BBa_E0430:YFP)、pSB1A2(BBa_I13507:RFP)も吸光度測定を行った

(2)　アルカリミニプレップ済の

pSB1A2(BBa_E0420:CFP)9/1付け、pSB1A2(BBa_E0430:YFP)9/1付け、

pSB1A2(BBa_I13507:RFP)9/1付け、pSB6A1(BBa_K121013)の制限酵素処理

　下の組成の通りに1.5mlエッペンに分注した

	pSB6A1 (BBa_K121013)	pSB1A2 (BBa_E0420:CFP)	pSB1A2 (BBa_I13507:RFP)	pSB1A2 (BBa_E0430:YFP)
DNA	80µl	70µl	110µl	90µl
H2O	9.4µl	19.4µl	24.4µl	44.4µl
H buffer	10µl	10µl	15µl	15µl
EcoRⅠ	0.3µl	0.3µl	0.3µl	0.3µl
PstⅠ	0.3µl	0.3µl	0.3µl	0.3µl
total	100µl	100µl	150µl	150µl

　↓37℃で一晩インキュベートした

【実験結果】

(1)　吸光度測定結果

8/31付け pSB1A2(BBa_E0420:CFP) (100倍希釈)
	1.176
	1.120
	1.104
	1.089
	1.088
平均	1.1154
濃度：5.58×103(µg/ml)

8/31付け pSB1A2(BBa_E0430:YFP) (100倍希釈)
	1.322
	1.310
	1.309
	1.292
	1.286
平均	1.3038
濃度：6.51×103(µg/ml)

8/31付けのpSB1A2(BBa_I13507:RFP)(100倍希釈)

　　　1.134

　　　1.114

　　　1.110

　　　1.102

　　　1.104

　平均：1.1128

　濃度：5.56×10³(µg/ml)

9/1付けのpSB1A2(BBa_E0420:CFP)(100倍希釈)

　　　1.318

　　　1.309

　　　1.316

　　　1.320

　　　1.327

　平均：1.318

　濃度：6.59×10³(µg/ml)

9/1付けのpSB1A2(BBa_E0430:YFP)(100倍希釈)

  　　1.567

　　　1.538

  　　1.528

　　　1.516 　　　1.490 　平均：1.5278 　濃度：7.64×10³(µg/ml)

9/1付けのpSB1A2(BBa_I13507:RFP)(100倍希釈) 　　　1.193 　　　1.169 　　　1.196 　　　1.188 　　　1.189 　平均：1.187 　濃度：5.935×10³(µg/ml)

pSB6A1(BBa_K121013)(100倍希釈)　 　　　1.390 　　　1.390 　　　1.378 　　　1.362 　　　1.336 　平均：1.3712 　濃度：6.91×10³(µg/ml)

(2)一晩、制限酵素処理した後、DNA抽出を行う。