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Contents

October 3

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Time

11:00~18:30

Member

岩城、福山、竹内、臼井、革島、吉村
Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Kawashima,Yoshimura

Purpose

(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション　[福山、革島]
(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)　[岩城]
(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養　[吉村]
(4)　ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR　[革島、吉村]

Method

(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション
＊ライゲーション
　pSB1C3 + SufA
　　　 　+ SufA+GFP
　　　　+ AhpC+GFP　　　　をそれぞれTotal20μLで3セットずつ調整
　↓16℃30min
＊トランスフォーメーション
　コンピテントセル100μLずつ加えた
　↓氷上30min
　↓42℃45min
　↓氷上2min
　↓SOC培地900μL加えた
　↓1h振とう培養
　↓ストリーク
(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)
　10/1にPCRをかけた続き(10/2の朝にPCRからだして冷凍保存しておいた)
　0.5 mlチューブに入っていたサンプルを1.5 ml チューブに移した
　↓3 M CH3COONaを1.5 μl加えた
　↓氷冷 15min.
　↓2-propanol 31.5 µl とMilli Q 7 µlを加えた
　↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
　↓上清を捨てた
　↓70 % EtOHを50 µlを加えた
　↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
　↓Remove sup.
　↓遠心乾燥した(良く乾かすこと)
　↓Hi-Di formamide 15 µlに溶かした
　↓95 ℃,2 min加熱した
　↓氷冷(急冷)
　↓0.5 mlチューブのふたを切ってサンプルを移した
　↓シークエンス用のゴムのふたをした
　↓シークエンサーにいれた
(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養
　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3を試験管で振とう培養した
(4)　ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR
　以下の組成とプログラムでPCRをahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,SacrAB,dpsの各プロモーターについて2本ずつおこなった
＊ahpC,sufA,oxyR,sodA
プライマー(PM)0.75ul
テンプレートDNA0.5ul
MgSO42ul
dNTPs2.5ul
KODplus0.5ul
Buffer2.5ul
Milli Q16.25ul
Total25ul
表2: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
94℃94℃61℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec1min2min∞
35サイクル
＊PCR産物の確認
　各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした
　↓1%アガロースゲルに＊と１kbpマーカー3μLを添加した
　↓135v,20minで電気泳動
　↓20minEtBr染色
　↓UV照射下でバンドの確認

Results

(1)　翌日24時間後までSufA以外コロニーが見られなかった
(2)　明日、シークエンスを確認
(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP)は培養に成功しているものもあったがpSB1C3に関しては翌日になるまで結果がわからない
(4)　吸光度を測定し濃度を計算した結果、
ahpC…1482ng/μl
　　2…360ng/μl
sufA1…265ng/μl
　　2…425ng/μl
oxyR1…367ng/μl
　　2…369ng/μl
sodA1…427ng/μl
　　2…340ng/μl
yaiA1…267ng/μl
　　2…481ng/μl
acrAB1…368ng/μl
　　2…557ng/μl
dps1…530ng/μl
　　2…440ng/μl
だった(全量は全て19μl)
＊電気泳動
　全てのバンドが正確な位置にはっきりと見られた

October 4

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Time

19：00~22:30

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1)　10月3日の実験(3)の結果の確認　[福山]
(2)　pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理　[福山]
(3)　SufA,ahpC,の制限酵素処理　[福山]
(4)　提出用ベクターpsB1C3のカットチェック　[福山]

Method

(1)　10月3日の実験(3)の結果の確認
　クロラムフェニコール入りのLB寒天培地にコロニーが見られるかどうかを確認した
(2)　pSB1C3(BBa_J04450)のアルカリミニプレップと制限酵素処理
　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
　↓上清をカラムに入れた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓4試料を合わせたので溶出液の全量が400 μlほどになった
　↓このうち5μlとって20倍希釈して吸光度を測定した(*1)
　　また、1kb ladderとともに、各試料を表1のように調整して電気泳動し、EtBrで10分間ほど染色した(*2)
　↓酢酸ナトリウム100 μlと2-プロパノールを800 μl加えた
　↓軽く振ってまぜ、4℃、14,500rpmで10分間遠心した
　↓上清を回収した
　↓70 %エタノールを800 μl加えた
　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した
　↓上清を除いた
　↓乾燥した
　↓30μlのTEに溶かした。このうち1 μlをとって100倍希釈し、吸光度を測定した(*3)
　↓(*2)にUVをあて、写真撮影をした
　↓写真でバンドを確認した後、表2のように調整して制限酵素処理をovernightで行った
表1: 制限酵素処理1
単位はμl試料1試料2試料3試料4
DNA溶液12.5131313
Buffer H1.51.51.5
EcoRⅠ0.50.5
PstⅠ0.50.5
全量15151513
表2: 制限酵素処理2
試料(μl)
DNA溶液29
Buffer H4
EcoRⅠ1
PstⅠ1
Milli Q5
全量40
(3)　SufA,ahpC,の制限酵素処理
　表3、表4の通りに調整して(それぞれ2試料ずつ)、制限酵素処理をovernightで行った
表3: sufA(total 25 μl)
DNAsol20 μl
EcoRⅠ0.5 μl
SpeⅠ0.5 μl
M buffer2.5μl
H2O1.5 μl
表4: ahpC(total 25 μl)
DNAsol20 μl
EcoRⅠ0.5 μl
SpeⅠ0.5 μl
M buffer2.5 μl
H2O1.5 μl
(4)　提出用ベクターpsB1C3のカットチェック
　ミニプレ後のpSB1C3の試料を以下のように制限処理した
　そして、制限酵素処理した2つの試料と
　制限酵素処理をしなかった試料の合わせて3つの試料を以下の様に電気泳動し、バンドを確認した
　↓135V ,20分で電気泳動
　↓EtBr で20分間染色
　　バンドを確認した
pSB1C3(total 25 μl)
DNAsol20 μl
EcoRⅠ1 μl
SpeⅠ1 μl
M buffer2.5 μl
H2O0.5μl
pSB1C3(total 25 μl)
DNAsol20 μl
SpeⅠ1 μl
M buffer2.5 μl
H2O1.5μl

Results

(1)　DH5α(pSB1C3(SufA))の3つのプレートのうちの一つだけでコロニーの形成が見られた。
あとのDH5α(pSB1C3(ahpC))やDH5α(pSB1C3(SufA,GFP))はコロニーが確認できなかった
(2) (*1)の結果：20倍希釈の吸光度の平均は0.17であったので、濃度：170 ng/μl
(*2)の写真では、ベクター,インサート,の大きさは間違いないようであった。
(*3)の結果から求めた濃度：1148 ng/μl　← 6.8倍濃縮
(3)　明日にインサートとベクターの全量を電気泳動し、
フェノールクロロフォルム処理、ライゲーション、トランスフォーメーションを行う
(4)　EcoRⅠ, SpeⅠで制限酵素処理した試料は1kbp付近で予想に反したバンドを確認した
他の2試料は予想通りであった

Consideration

(4)　クロラムフェニコールが十分でなかったため、他の大腸菌が増えた可能性が考えられる
次回からはクロラムフェニコールを十分に付加すべきである

October 5

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October 6

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Time

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1)　DH5α( pSB1C3(sufA)), DH5α( pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ　[福山]
(2)　前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA), pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]

Method

(1)　DH5α( pSB1C3(sufA)), DH5α( pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ
　前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが見られたので
　ピックアップして、それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、37℃で振5時間程振とう培養した
　↓遠心１分（25℃、14,500 rpm）して集菌
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分（25℃、14,500 rpm）
　↓上清を新しいチューブに移した
　↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）
　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
　↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）
　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
　↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）
　↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
　↓カラムにMilliQを100 μl加えた
　↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）
　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
　↓遠心20分（4℃、15,000 rpm）(*1)
　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
　↓遠心5分（4℃、15,000 rpm）
　↓上清を捨て、乾燥させた
　↓5 μlのMilli Qに溶かし4℃で保存した。そのうち1 μlはErBr入りのアガロースゲルを使って電気泳動した(*2)
(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
　Premix 2 μl
　5xsequence buffer 1 μl
　Primer(1 μM) 1.6 μl
　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
　総量 10 μl
表1: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
96℃96℃50℃60℃4℃
1min10sec5sec4min∞
30サイクル
エタノール沈殿
　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
　↓氷上で15分間冷やした
　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
　↓50 μlの70 % エタノールを加えた
　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
　↓乾燥させた(よく乾かした)
　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
　↓95 ℃で2分加熱した
　↓氷上で冷やした(急冷)
　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
　↓シークエンス用の蓋をした
　↓シークエンサーに入れた

Results

(1)　(*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったので、
DNAの濃度を確かめる為に(*2)で電気泳動を行いバンドが見られるか確認した
その結果、バンドが観察されたので、明日以降PCRを行うのに有効なDNA試料であると思われる
(2)　十分に正確な塩基配列を読むことができなかった

Consideration

(1)　(*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったのは、培養時間が短く
(今回は5時間だったが、ベクターがpSB1C3の時は、今まではたいてい10時間以上培養していた)
DH5αが十分に増殖しておらず、プラスミドの濃度が低かったからだと思われる
(2)　コンタミの可能性が考えられる

October 7

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Time

18:00~

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ　[福山]
(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]

Method 【実験方法】

(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ
　前日の14時から今日の午前まで培養していたDH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))を
　遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
　↓上清を新しいチューブに移した
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し替えた
　↓カラムにMilliQを100 μl加えた
　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
　↓上清を捨て、乾燥させた
　↓それぞれの乾燥DNAを30 μlのMilliQに溶かした
　　このうち1 μlずつとってMilliQで100倍希釈した溶液の吸光度(260nm)を測定した


(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
　H2O 全量10 μlになるように調整した
　Premix 2 μl
　5xsequence buffer 1 μl
　Primer(1 μM) 1.6 μl
　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
　総量 10 μl
表1: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
96℃96℃50℃60℃4℃
1min10sec5sec4min∞
30サイクル
エタノール沈殿
　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
　↓氷上で15分間冷やした
　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
　↓50 μlの70 % エタノールを加えた
　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
　↓乾燥させた(よく乾かした)
　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
　↓95 ℃で2分加熱した
　↓氷上で冷やした(急冷)
　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
　↓シークエンス用の蓋をした
　↓シークエンサーに入れた

Results (1)100倍希釈したDNA溶液の吸光度の測定結果を表2に示す

表2: 吸光度測定結果
ahpC-1ahpC-2sufA-1sufA-2
0.0660.1181.0050.022
0.0530.1140.6810.023
0.0550.1110.4920.024
0.0480.1060.4480.016
0.0470.1030.3280.015
0.276
平均0.05380.11040.53830.02
希釈前の濃度
(ng/μl)		2695522692100
(2)　後日、シークエンス結果を得たが、十分に塩基配列を読めていなかった

Consideration

(2)　RNA処理が十分に行われたいなかった可能性が高い
次回からはアルカリミニプレップなどでのRNA処理を十分にすべき

October 8

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October 9

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