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October 3

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Time

11:00~18:30

Member

岩城、福山、竹内、臼井、革島、吉村
Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Kawashima,Yoshimura

Purpose

(1) 昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション [福山、革島]
(2) pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き) [岩城]
(3) ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養 [吉村]
(4) ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR [革島、吉村]

Method

(1) 昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション
*ライゲーション
 pSB1C3 + SufA
     + SufA+GFP
    + AhpC+GFP    をそれぞれTotal20μLで3セットずつ調整
 ↓16℃30min
*トランスフォーメーション
 コンピテントセル100μLずつ加えた
 ↓氷上30min
 ↓42℃45min
 ↓氷上2min
 ↓SOC培地900μL加えた
 ↓1h振とう培養
 ↓ストリーク
(2) pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)
 10/1にPCRをかけた続き(10/2の朝にPCRからだして冷凍保存しておいた)
 0.5 mlチューブに入っていたサンプルを1.5 ml チューブに移した
 ↓3 M CH3COONaを1.5 μl加えた
 ↓氷冷 15min.
 ↓2-propanol 31.5 µl とMilli Q 7 µlを加えた
 ↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
 ↓上清を捨てた
 ↓70 % EtOHを50 µlを加えた
 ↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)
 ↓Remove sup.
 ↓遠心乾燥した(良く乾かすこと)
 ↓Hi-Di formamide 15 µlに溶かした
 ↓95 ℃,2 min加熱した
 ↓氷冷(急冷)
 ↓0.5 mlチューブのふたを切ってサンプルを移した
 ↓シークエンス用のゴムのふたをした
 ↓シークエンサーにいれた
(3) ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養
 ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3を試験管で振とう培養した
(4) ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR
 以下の組成とプログラムでPCRをahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,SacrAB,dpsの各プロモーターについて2本ずつおこなった
*ahpC,sufA,oxyR,sodA
プライマー(PM)0.75ul
テンプレートDNA0.5ul
MgSO42ul
dNTPs2.5ul
KODplus0.5ul
Buffer2.5ul
Milli Q16.25ul
Total25ul
表2: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
94℃94℃61℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec1min2min
35サイクル
*PCR産物の確認
 各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした
 ↓1%アガロースゲルに*と1kbpマーカー3μLを添加した
 ↓135v,20minで電気泳動
 ↓20minEtBr染色
 ↓UV照射下でバンドの確認

Results

(1) 翌日24時間後までSufA以外コロニーが見られなかった
(2) 明日、シークエンスを確認
(3) ahpC(on GFP),sufA(on GFP)は培養に成功しているものもあったがpSB1C3に関しては翌日になるまで結果がわからない
(4) 吸光度を測定し濃度を計算した結果、
ahpC…1482ng/μl
  2…360ng/μl
sufA1…265ng/μl
  2…425ng/μl
oxyR1…367ng/μl
  2…369ng/μl
sodA1…427ng/μl
  2…340ng/μl
yaiA1…267ng/μl
  2…481ng/μl
acrAB1…368ng/μl
  2…557ng/μl
dps1…530ng/μl
  2…440ng/μl
だった(全量は全て19μl)
*電気泳動
 全てのバンドが正確な位置にはっきりと見られた

October 4

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October 5

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October 6

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Time

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1) DH5α( pSB1C3(sufA)), DH5α( pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ [福山]
(2) 前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA), pSB1C3(ahpC)のシークエンス [竹内]

Method

(1) DH5α( pSB1C3(sufA)), DH5α( pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ
 前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが見られたので
 ピックアップして、それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、37℃で振5時間程振とう培養した
 ↓遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
 ↓上清を捨てた
 ↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
 ↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
 ↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
 ↓上清を新しいチューブに移した
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓カラムを新しいエッペンに移し替えた
 ↓カラムにMilliQを100 μl加えた
 ↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
 ↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
 ↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
 ↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
 ↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)
 ↓上清を捨て、乾燥させた
 ↓5 μlのMilli Qに溶かし4℃で保存した。そのうち1 μlはErBr入りのアガロースゲルを使って電気泳動した(*2)
(2) 前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
 Premix 2 μl
 5zsequence buffer 1 μl
 Primer(1 μM) 1.6 μl
 プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した
 総量 10 μl
表1: PCR設定
Pre DenatureDenatureAnnealingExtention+Extention
96℃96℃50℃60℃4℃
1min10sec5sec4min
30サイクル
エタノール沈殿
 ↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した
 ↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
 ↓氷上で15分間冷やした
 ↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた
 ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 ↓50 μlの70 % エタノールを加えた
 ↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた
 ↓乾燥させた(よく乾かした)
 ↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
 ↓95 ℃で2分加熱した
 ↓氷上で冷やした(急冷)
 ↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った
 ↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した
 ↓シークエンス用の蓋をした
 ↓シークエンサーに入れた

Results

(1) (*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったので、
DNAの濃度を確かめる為に(*2)で電気泳動を行いバンドが見られるか確認した
その結果、バンドが観察されたので、明日以降PCRを行うのに有効なDNA試料であると思われる
(2) 十分に正確な塩基配列を読むことができなかった

Consideration

(1) (*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったのは、培養時間が短く
(今回は5時間だったが、ベクターがpSB1C3の時は、今まではたいてい10時間以上培養していた)
DH5αが十分に増殖しておらず、プラスミドの濃度が低かったからだと思われる
(2) コンタミの可能性が考えられる

October 7

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October 9

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