トランスフォーメーション | Bacterial transformation |
↓氷上でコンピテント細胞(DH5α:大腸菌株)を融かす | ↓Thaw competent cells(DH5 Alpha:E.coli strain) on ice. |
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 μlのコンピテント細胞を分注する、余ったコンピテント細胞は-80 ℃の冷凍庫に戻す | ↓Aliquot 100 μl cells into pre-chilled 1.5 ml tube.Put excess competent cells back into the -80℃ freezer. |
↓DNAをチューブに1~5 μl加えて、氷上で30分間冷やす | ↓Add DNA (1 to 5 μl) to tube, incubate on ice for 30 minutes. |
↓42 ℃で45秒間熱ショックを与える | ↓Heat shock the cells at 42 ℃ for 45 seconds. |
↓0.9 mlのSOC培地を加える | ↓Add 0.9 ml SOC medium. |
↓37 ℃で1時間、振りながら回復培養する | ↓Rescue at 37 ℃ for 1 hour, shaking. |
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまく | ↓Spread 1 ml on LB plates(Either +amp,+kan or +cam) |
↓37 ℃で一晩培養する | ↓Clutivate overnight in 37 ℃ . |
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
アルカリミニプレップ | DNA miniprep |
SolutionⅠ | 50 mM グルコース (MW 180) |
| 10mM EDTA(pH 8.0) |
| 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) |
SolutionⅡ | 0.2 N NaOH |
| 1 % SDS |
SolutionⅢ | 3 M 酢酸カリウム |
| 1.8 M 酢酸 |
| SolutionⅠ | 50 mM glucose (MW 180) |
| 10mM EDTA(pH 8.0) |
| 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) |
SolutionⅡ | 0.2 N NaOH |
| 1 % SDS |
SolutionⅢ | 3 M potassium acetate |
| 1.8 M acetic acid |
|
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37 ℃で一晩培養する | ↓Streak E.coli to LB plates(Either +amp,+kan or +cam) and cultivate overnight in 37 ℃. |
↓プレートからシングルコロニーを分離する | ↓Pick up a single colony from plate. |
↓2 mlのLB培地で37 ℃で一晩振とう培養する | ↓Cultivate in 2 ml LB medium overnight in 37 ℃,shaking. |
↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつす | ↓Pipet 1.5 ml of overnight culture into a 1.5 ml tube. |
↓15,000 rpm、4 ℃で1分間遠心し、 上清を捨てる | ↓Centrifuge for 1 minute at 15,000 rpm in 4 ℃ and discard the supernatant. |
↓100 μlの氷冷したSolutionⅠを沈殿に加え、懸濁する | ↓Add 100 μl of refrigerated SolutionⅠ to the pellet and vortex to resuspend. |
|
↓200 μlのSolutionⅡを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない | ↓Add 200 μl of SolutionⅡ and invert gently to mix. Do not vortex. |
↓氷上で5分間冷やす | ↓Incubate on ice for 5 minutes. |
↓150 μlの氷冷したSolutionⅢを加え、穏やかに反転し混ぜる、ボルテックスは使用しない | ↓Add 150 μl of refrigerated SolutionⅢ and invert gently to mix. Do not vortex. |
↓氷上で5分間冷やす | ↓Incubate on ice for 5 minutes. |
↓15,000 rpm、4 ℃で5分間遠心する | ↓Centrifuge for 5 minutes at 15,000 rpm in 4 ℃. |
↓400 μlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとる | ↓Carefully pipet 400 μl of the clean supernatant into a new tube. |
↓900 μlの2-プロパノールを加え、混ぜる | ↓Add 900 μl of 2-propanol and mix. |
↓2分間室温で放置する | ↓Incubate for 2 minutes in room temperature. |
↓15,000 rpm、4 ℃で10分間遠心し、上清を捨てる | ↓Centrifuge for 10 minutes at 15,000 rpm in 4 ℃ and discard supernatant. |
↓1 mlの70 %エタノールを加える | ↓Add 1ml 70% EtOH to the pellet. |
↓15,000 rpm、4 ℃で2分間遠心し、上清を捨てる |
↓Centrifuge for 2 minutes at 15,000 rpm in 4 ℃ and discard supernatant. |
↓沈殿を10分から15分乾かす | ↓Dry the pellet for 10-15 minutes. |
↓プラスミドDNAを30 μlのRNaseのはいったTEに溶かす | ↓Resuspend the plasmid DNA in 30 μl of TE with RNase. |
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) | Polymerase Chain Reaction(PCR) |
↓ソフトウェアプログラムを使って、プライマーの設計をする | ↓Design primers with software programs. |
http://ginkgobioworks.com/cgi/primer.cgi | http://ginkgobioworks.com/cgi/primer.cgi |
↓下記の組成に従って試薬を混ぜる | ↓Mix the reagent according to the following components. |
Primer Mix | 1.5 μl |
鋳型 DNA | 0.5 μl |
10×PCR Buffer for KOD-Plus- | 5 μl |
2mM dNTPs | 5 μl |
2mM MgSO4 | 4 μl |
ddH2O | 33 μl |
KOD-Plus- | 1 μl |
| 総量 50 μl | |
Primer Mix | 1.5 μl |
Template DNA | 0.5 μl |
10×PCR Buffer for KOD-Plus- | 5 μl |
2mM dNTPs | 5 μl |
2mM MgSO4 | 4 μl |
ddH2O | 33 μl |
KOD-Plus- | 1 μl |
| 50 μl system | |
↓PCRのプログラム設定 | ↓PCR program |
Start | 94 ℃、2分 |
Cyclet×35 | 94 ℃、15秒 (熱変性) |
| (Tm-10) ℃、0.5分 (アニーリング) |
| 68 ℃、1kb/min (伸長) |
End | 68 ℃、2分 |
| 4 ℃で保つ |
| Start | 94 ℃ for 2 minutes. |
Cycle×35 | 94 ℃ for 15 seconds. (denaturing) |
| (Tm-10) ℃ for 0.5 minutes. (annealing) |
| 68 ℃ for 1kb/min. (extension) |
End | 68 ℃ for 2 minutes. |
| Keep at 4 ℃ forever. |
|
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
制限酵素処理 | DNA digestion by restriction enzymes |
↓下記の組成に従って試薬を混ぜる | ↓Mix the reagent according to the following components. |
|
10X Buffer H buffer M buffer | 2 μl |
DNA solution | Adjust for the amount of DNA to become 1 μg. |
Restriction enzyme EcoRⅠ XbaⅠ PstⅠ SpeⅠ | Adjust to become 3 units. |
H2O | Adjust to become total 20 μl. |
| 20 μl system | |
↓37 ℃で1時間放置する | ↓Incubate for 1 hour in 37 ℃. |
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
アガロースゲル電気泳動 | Agarose gel electrophoresis |
50×TAE | Tris base 242 g |
| 無水酢酸 57.1 ml |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) 100ml |
| H2Oを加えて1 Lにする |
1x TAEを作るには、20mlの50X TAEに980 mlのH2Oを加える |
50×TAE | 242g Tris base |
| 57.1 ml of glacial Acetic acid |
| 100ml of 0.5M EDTA (pH 8.0) |
| Make up to 1 L with water |
To make 1x TAE from 50X TAE stock, dilute 20ml of stock into 980 ml of deionised water. |
↓ゲルに使用するアガロースの量は扱うDNAによって変わるので下記の表に従えばよい
アガロース濃度 (g/100 ml) | 最適なDNAの長さ(kb) |
0.5 | 1 - 30 |
0.7 | 0.8 - 12 |
1.0 | 0.5 - 10 |
1.2 | 0.4 - 7 |
1.5 | 0.2 - 3 |
例えば、1 % ゲルを作るには、1 gのアガロースをフラスコに量りとり、100 mlの1 x TAEを加える | ↓The amount of agarose to use in your gel depends on the DNA in question. Use the following table as a rough guide.
Agarose Concentration (g/100 ml) | Optimal DNA Length (kb) |
0.5 | 1 - 30 |
0.7 | 0.8 - 12 |
1.0 | 0.5 - 10 |
1.2 | 0.4 - 7 |
1.5 | 0.2 - 3 |
For example, to make a 1 % agarose gel, weigh out 1 g of agarose into a flask and add 100 ml of 1 x TAE. |
↓電子レンジでアガロースが完全に溶けるまで加熱する | ↓Heat solution in a microwave until agarose is completely dissolved. |
↓素手でフラスコの底が触れるまで冷ます | ↓Let the agarose cool until touching the bottom of a flask with your bare hand. |
↓ゲルトレーにゲルを注ぎ、コームを挿す | ↓Pour into gel tray and insert comb(s). |
↓室温で15分から30分間冷ます | ↓Allow to cool for 15-30 minutes at room temperature. |
↓コームを外し、電気泳動槽にうつして、1 x TAEに浸す | ↓Remove comb(s), place in electrophoresis chamber and cover with 1 × TAE. |
↓サンプルに6×ローディングダイを加える | ↓Add 6×loading dye to samples. |
↓DNAとマーカー(100 bp DNA ladder,1 kb DNA ladder)をゲルにのせる | ↓Load DNA and standard (100 bp DNA ladder,1 kb DNA ladder) onto gel. |
↓100 Vで20分間電気泳動する | ↓Electrophorese at 100 V for 20 minutes. |
↓EtBrでゲルを30分間染色する | ↓Dye gel with EtBr for 30 minutes. |
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する | ↓Visualize DNA bands using UV lightbox. |
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
ゲルからのDNA抽出 | Isolation of DNA fragments from agarose gel |
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する | We use QIAquick Gel Extraction Kit.
|
↓TAEに溶かした低融点のアガロースゲルをつくる | ↓Make a low-melt agarose gel in TAE. |
↓DNAとマーカーをゲルにのせる | ↓Load DNA and standard onto gel. |
↓75 Vで45分間電気泳動する | ↓Electrophorese at 75 V for 45 minutes. |
↓EtBrでゲルを40分間染色する | ↓Dye gel with EtBr for 40 minutes. |
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する | ↓Visualize DNA bands using UV lightbox. |
↓綺麗で鋭い手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす | ↓Excise the DNA fragment from the agarose gel with a clean, sharp scalpel. |
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る | ↓Weigh the gel slice in 1.5 ml tube. |
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加える | ↓Add 3 volumes of Buffer QG to 1 volume of gel (100 mg ~ 100 μl). |
↓42-50 ℃で10分間放置し、ゲルを完全に溶かす | ↓Incubate at 42-50 ℃ for 10 minutes or until gel is fully dissolved. |
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する | ↓After the gel slice has dissolved completely, check that the color of the mixture is
yellow. |
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜる | ↓Add 1 gel volume of 2-propanol to the sample and mix. |
↓カラムにサンプルをのせる | ↓Apply sample to column in a collection tube. |
↓15,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる | ↓Centrifuge for 1 minute at 15,000 rpm and discard flow-through. |
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加えね残りのゲルを溶かす | ↓Add 500 μl of Buffer QG to column to dissolve residual agarose. |
↓15,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる | ↓Centrifuge for 1 minute at 15,000 rpm and discard flow-through. |
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加える | ↓Add 750 μl of wash Buffer PE to column. |
↓15,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる | ↓Centrifuge for 1 minute at 15,000 rpm and discard flow-through. |
↓15,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる(残りのエタノールを除くため) | ↓Centrifuge for 1 minute at 15,000 rpm and discard flow-through (to eliminate residual ethanol). |
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる | ↓Place column into a clean 1.5 ml tube. |
↓30 μlのelution Buffer EBをカラムの中央に加える | ↓Add 30 μl of elution Buffer EB to center of column. |
↓1分間立たせておく | ↓Let stand for 1 minute. |
↓15,000 rpmで1分間遠心する | ↓Centrifuge for 1 minute at 15,000 rpm. |
↓集めたDNAは1.5 mlチューブに入れて-20 ℃で保存する | ↓Store DNA collected in 1.5 ml tube at -20 ℃. |
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
ライゲーション | DNA ligation |
Rapid DNA Ligation Kitを使用する | We use Rapid DNA Ligation Kit. |
↓下記の組成に従って試薬を混ぜる | ↓Mix the reagent according to the following components. |
5x DNA dilution buffer | 2 μl |
ベクター(カット・CHIP処理後) | 0.25-1 μl |
インサート DNA | 0.5-6.5 μl |
ddH2O | 全量が10 μlになるように調整する |
| 5x DNA dilution buffer | 2 μl |
Vector(cut and CHIP treated) | 0.25-1 μl |
Insert DNA | 0.5-6.5 μl |
ddH2O | To final volume of 10 μl |
|
↓よく混ぜる | ↓Mix well. |
↓10 μlの2X rapid ligation bufferと1 μlのligaseを加える | ↓Add 10 μl of 2X rapid ligation buffer and 1 μl ligase. |
↓よく混ぜる | ↓Mix well. |
↓室温で5分間放置する | ↓Hold at room temperature for 5 minutes. |
↓トランスフォーメーションに使用するときは、100 μlのコンピテント細胞に対して10 μl使用する | ↓Then use 10 μl of the ligation reaction to transform 100 μl of chemically competent cells. |
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
コンピテント細胞の作製 | Preparing chemically competent cells |
↓E.coli (DH5α)をLBプレートにまき、37 ℃で一晩培養する | ↓Streak E.coli (DH5α) to LB plate and cultivate overnight in 37 ℃. |
↓シングルコロニーをピックアップして、2 mlのSOB培地で37 ℃で6時間培養する | ↓Pick up a single colony from plate and cultivate 2 ml of SOB medium for 6 hours in 37 ℃. |
↓培養液を250 mlのSOB培地に加える | ↓Add 2 ml of the cluture 250 ml of SOB medium. |
↓遠心しながら、37 ℃で吸光度(OD600)が0.4-0.8になるまで培養する | ↓Cultivate at 37°C with agitation until the Optical Density (OD600) reaches 0.4-0.8. |
↓培養液を50 mlの遠心チューブに移し、氷上で10分間冷やす | ↓Transfer the culture into 50 ml centrifuge tube and incubate the culture on ice for 10 minutes. |
↓4,500 rpm、4 ℃で10分間遠心し、上清を捨てる | ↓Centrifuge for 10 minutes at 4,500 rpm in 4 ℃ and discard the supernatant. |
↓84 mlの氷冷したTBを加えて、懸濁する | ↓Add 84 ml of refrigerated TB and resuspend. |
↓氷上で10分間冷やす | ↓Incubate on ice for 10 minutes. |
↓4,500 rpm、4 ℃で10分間遠心し、上清を捨てる | ↓Centrifuge for 10 minutes at 4,500 rpm in 4 ℃ and discard the supernatant. |
↓20 mlの氷冷したTBを加えて、懸濁する |
↓Add 20 ml of refrigerated TB and resuspend. |
↓1.4 mlのDMSO(7 %)を加える | ↓Add 1.4 ml of DMSO(7 %). |
↓氷上で10分間冷やす | ↓Incubate on ice for 10 minutes. |
↓300 μlずつ分注する | ↓Aliquot 300 μl of the cells. |
↓液体窒素で冷凍する | ↓Freeze the cells in liquid nitrogen. |
↓-80 ℃で保存する | ↓Store at -80 ℃. |
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
シークエンス | Sequencing |
PCR | PCR |
↓下記の組成に従って試薬を混ぜる | ↓Mix the reagent according to the following components. |
H2O | 全量10 μlになるように調整する |
Premix | 2 μl |
5×sequence buffer | 1 μl |
Primer(1 μM) | 1.6 μl |
プラスミド DNA | DNA量が100-250 ngになるように調整する |
| 総量 10 μl |
| H2O | Adjust to become total 10 μl |
Premix | 2 μl |
5×sequence buffer | 1 μl |
Primer(1 μM) | 1.6 μl |
Plasmid DNA | Adjust for the amount of DNA to become about 100-250 ng. |
| 10 μl system |
|
↓PCRのプログラム設定 | ↓PCR program |
Start | 96 ℃、1分 |
Cycle x 30 | 96 ℃、10秒 |
| 50 ℃、5秒 |
| 60 ℃、4分 |
End | 4 ℃で保つ |
| Start | 96 ℃ for 1 minute. |
Cycle x 30 | 96 ℃ for 10 seconds. |
| 50 ℃ for 5 seconds. |
| 60 ℃ for 4 minutes. |
End | Keep at 4 ℃ forever. |
|
エタノール沈殿 | EtOH precipitation |
↓PCRの後、1.5 mlチューブに移す | ↓Remove 1.5 ml tube after PCR. |
↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加える | ↓Add 1.5 μl of 3 M CH3COONa. |
↓氷上で15分間冷やす | ↓Incubate on ice for 15 minutes. |
↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加える | ↓Add 31.5 μl of 2-propanol and 7 μl of H2O. |
↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てる | ↓Centrifuge for 20 minutes at 15,000 rpm in 4 ℃ and discard the supernatant. |
↓50 μlの70 % エタノールを加える. | ↓Add 50 μl of 70 % EtOH. |
↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てる | ↓Centrifuge for 20 minutes at 15,000 rpm in 4 ℃ and discard the supernatant. |
↓乾燥させる(よく乾かす) | ↓Dry up.(Dry it well.) |
↓15 μlのHi-Di formamideに溶かす | ↓Dissolve in 15 μl of Hi-Di formamide. |
↓95 ℃で2分加熱する | ↓Incubate for 2 minutes at 95 ℃. |
↓氷上で冷やす(急冷) | ↓Incubate on ice(rapid cooling). |
↓0.5 mlチューブの蓋を切り取る | ↓Cut out the cap of the 0.5 ml tube. |
↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移す | ↓Remove the sample in the 1.5 ml tube to 0.5 ml tube. |
↓シークエンス用の蓋をする | ↓Do the cap for the sequencing. |
↓シークエンサーに入れる | ↓Take the sample in to sequencer. |
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
グリセロールストック | Glycerol stock |
↓E.coli (DH5α)をLBプレートにまき、37 ℃で一晩培養する | ↓Streak E.coli (DH5α) to LB plate and cultivate overnight in 37 ℃. |
↓シングルコロニーをピックアップして、2 mlのLB培地で37 ℃で一晩培養する | ↓Pick up a single colony from plate and cultivate 2 ml of LB medium overnight in 37 ℃. |
↓1.5 mlチューブ内で500 μlの培養液を500 μLの50 %グリセロールに加える | ↓Add 500 μl of an overnight culture to 500 μL of 50 % glycerol in a 2 mL screw top tube. |
↓-80 ℃でグリセロールストックを冷凍する | ↓Freeze the glycerol stock tube at -80 ℃. |
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
LB培地 | LB culture medium |
↓下記の組成に従って試薬を混ぜる | ↓Mix the reagent according to the following components. |
Bacto Tryptone | 10 g |
Extract of Yeast | 5 g |
NaCl | 1 g |
H2O | 1 L |
| Bacto Tryptone | 10 g |
Extract of Yeast | 5 g |
NaCl | 1 g |
H2O | 1 L |
|
↓121 ℃で20分間オートクレーブする | ↓Autoclave for 20 minutes at 121 ℃. |
LBプレートを作るときは、20 gの寒天を加え、オートクレーブ後、20 mlずつプレートに温かい培地を注ぐ | If you make LB plates, add 20 g of agar and after autoclave pour 20 ml of warm media into each plate. |
抗生物質入りのプレートを作るときは、オートクレーブ後、冷めた培地に抗生物質を加える | If you make LB plates with the antibiotic, after autoclave add the antibiotic to the medium cooled. |
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
2×YT培地 | 2×YT culture medium |
↓下記の組成に従って試薬を混ぜる | ↓Mix the reagent according to the following components. |
Bacto Tryptone | 16 g |
Extract of Yeast | 10 g |
NaCl | 5 g |
H2O | 1 L |
| Bacto Tryptone | 16 g |
Extract of Yeast | 10 g |
NaCl | 5 g |
H2O | 1 L |
|
↓121 ℃で20分間オートクレーブする | ↓Autoclave for 20 minutes at 121 ℃. |
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
SOB培地 | SOB culture medium |
↓下記の組成に従って試薬を混ぜる | ↓Mix the reagent according to the following components. |
Bacto Tryptone | 20 g |
Extract of Yeast | 5g |
5M NaCl | 2ml |
2M KCl | 1.25 ml |
| Bacto Tryptone | 20 g |
Extract of Yeast | 5g |
5M NaCl | 2ml |
2M KCl | 1.25 ml |
|
↓121 ℃で20分間オートクレーブする | ↓Autoclave for 20 minutes at 121 ℃. |
↓10 mlの2M Mg solution (1 M MgSO4・7H2O +1 M MgCl2・6H2O)を加える | ↓Add 10 ml of 2M Mg solution (1 M MgSO4・7H2O +1 M MgCl2・6H2O). |
---------------------------------------------------- | ---------------------------------------------------- |
SOC培地 | SOC culture medium |
↓下記の組成に従って試薬を混ぜる | ↓Mix the reagent according to the following components. |
Bacto Tryptone | 20 g |
Extract of Yeast | 5g |
5M NaCl | 2ml |
2M KCl | 1.25 ml |
| Bacto Tryptone | 20 g |
Extract of Yeast | 5g |
5M NaCl | 2ml |
2M KCl | 1.25 ml |
|
↓121 ℃で20分間オートクレーブする | ↓Autoclave for 20 minutes at 121 ℃. |
↓10 mlの2M Mg solution (1 M MgSO4・7H2O +1 M MgCl2・6H2O)を加える | ↓Add 10 ml of 2M Mg solution (1 M MgSO4・7H2O +1 M MgCl2・6H2O). |
↓培地が50 ℃以下に冷めた後、20 mlの滅菌済みの20 %グルコース溶液を加える | ↓After cooling medium to less than 50°C, add 20 ml filter sterilized 20% glucose solution. |