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Template:KIT-Kyoto-week5
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Revision as of 11:50, 7 October 2010
Contents |
September 5
Time
- 9：30～
Member
- 岩城、竹内、吉村
- Iwaki,Takeuchi,Yoshimura
Purpose
- (1) 前日にシングルコロニーピックアップをしたpSB1C3(J04450)を
- 制限酵素処理を行うことにより、目的プラスミドの挿入を確認した
- (2) プロモーター挿入用のpSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507)
- インサートを切り出してI13507の挿入用のpSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出
- (3) ライゲーションとトランスフォーメーション
Method
- (1) pSB1C3のプラスミド抽出と制限酵素処理による確認
- 前日に2つのシングルコロニーをピックアップし2 mlのLB培地(+Cam)で37℃で一晩培養した
- ↓1.5 mlをチューブに採った
- ↓25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓カラムを新しいチューブに乗せ換えた
- ↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- それぞれ10 µlを別のチューブに採った
- ↓H bufferを5 µl加えた
- ↓蒸留水を34 µl加えた
- ↓EcoRⅠとPstⅠを0.5 µlずつ加えた
- ↓37℃で1.5時間インキュベートした
- ↓1 %ゲルを用いて、100 Vで25分間電気泳動した
- ↓20分間EtBrで染色した
- ↓紫外線を照射し写真を撮影した
- (2) pSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出
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- (3) ライゲーションとトランスフォーメーション
- コンピテントセルにDNAを入れた
- ↓20分間氷冷した
- ↓43℃のウォーターバスに45秒間いれた
- ↓5分間氷冷した
- ↓SOC培地を900μl加えた
- ↓20分間,37℃のインキュベーターに入れた
- ↓13000rpm,4℃,1分間遠心した
- ↓培養液を少し捨て量を減らし、ピペッティングした
- LBプレートにまき、37℃のインキュベーターに入れてovernight
Results
- (1) 以下のようにサンプルを泳動した
レーン1 1Kb Maker レーン2 コロニー1から抽出したプラスミド レーン3 コロニー1から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの レーン4 コロニー2から抽出したプラスミド レーン5 コロニー2から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの
- レーン2と4で同じ長さのバンドが確認できた
- またレーン3と5では2本のバンドが確認でき、3と5で長さに違いはなかった
- (2) RFPのバンドが見られなかった
- (3) 全てのプレートでコロニーの生育が見られた
Consideration
- (1) pSB1C3はベクター2072bp・インサート1069bpであり、
- インサート部分の両端に今回使用した制限酵素で切断できる部位をもつので
- 電気泳動の結果と照らし合わせるとどちらのコロニーも目的プラスミドの挿入がなされていると考えられる
- これを用いてマスタープレート・グリセロールストックの作成をする
- (2) 制限酵素処理に失敗したと思われる
September 6
Time
- 8:30～20:30
Member
- 岩城
- Iwaki
Purpose
- (1) pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のプラスミドを抽出する
- (2) pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)を制限酵素処理する
- (3) pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のゲル抽出
- (4) RFP・CFP・YFPをpSB1A2からpSB6A1に乗せ換える
- AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターをpSB6A1(K121013)のRBSの前に挿入する
Method
- (1) プラスミド抽出
- pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)の
- 4種のプラスミドの抽出をした(カラムを使用したミニプレップ)
- (2) 制限酵素処理
- (1)で抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した
- (1)で抽出したpSB6A1(K121013)を2つに分け、RFP,CFP,YFP用とpromoter用とした
- RFP,CFP.YFP用をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した
- promoter用をEcoRⅠとXbaⅠの2種の制限酵素で切断した
- (3) ゲル抽出
- (2)で制限酵素処理したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の
- インサートと pSB6A1(K121013)のベクターのゲル抽出を行った(青ゲル)
- (4) LigationとTrans formation
- (3)でゲル抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の
- インサートと pSB6A1(K121013)(RFP,CFP,YFP用)のLigationを行った
- 前日にゲル抽出済みの AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターと
- (3)でゲル抽出したpSB6A1(K121013)(promoter用)のLigationを行った
- LigationしたものをTFして、プレートを37℃・overnightでインキュベートした
Results
- ゲル抽出の際にpSB1A2(I13507)のバンドが確認できなかったため抽出できなかった
- それ以外に関してはTFまで完了した
- 以下の計5種
- pSB6A1(E0430)
- pSB6A1(E0420)
- pSB6A1(K362007)
- pSB6A1(K362011)
- pSB6A1(K362013)
Consideration
- 試験管3本分ではゲル抽出でバンドがでない可能性が高い
- 確実にゲル抽出するためには5本以上の試験管での培養が必要と考えられる
September 7
Time
- 9：00～
Member
- 岩城、福山、竹内、中村
- Iwaki,fukuyama,Takeuchi,Nakamura
Purpose
- (1) DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP)),DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP)),
- DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP)),DH5α(pSB6A1(SodA,GFP)),
- DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))のコロニーをピックアップ [福山]
- (2) AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理 [福山]
- (3) pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮 [福山]
- (4) AcrABのPCR [中村]
- (5) pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ
- (6) lacZのアルカリミニプレップ
Method
- (1) コロニーをピックアップ
- DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP))
- DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP))
- DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP))
- DH5α(pSB6A1(SodA,GFP))
- DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))
- それぞれのコロニーを32個ずつピックアップし、LBプレート(+amp)にストリークした
- ↓37℃でインキュベートした
- (2) AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理
- PCR処理済みのAcrAB溶液400μlにMilliQ200μl加えた
- ↓フェノールクロロホルム溶液を1.2mlほど加えてピペッティングし、vortexした
- ↓室温、14,500rpmで5分間遠心した
- ↓上清を回収し、これに2-プロパノールを1.2mlほど加えた
- ↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した
- ↓上清を捨て、70％エタノールを1.2mlほど加えた
- ↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した
- ↓上清を捨てた
- ↓遠心乾燥機で乾燥した
- ↓MilliQを30μl加えた
- ↓5μlとって2％アガロースゲル電気泳動で確認した(300bpあたりにバンドが見えた)
- ↓100倍希釈で吸光度を計測した
- ↓濃縮したプラスミド溶液24μlに下表2に従い各試薬を加えた
- ↓調整した試料を37℃で一晩インキュベートした
表1: 吸光度計測結果 AD260 0.071 0.069 0.069 0.07 0.071 平均 0.07 表2: 試薬組成 AcrAB 24μl EcoRⅠ 0.84μl PstⅠ 0.933μl H Buffer 2.6μl MilliQ 21.6μl 全量 約50μl
- (3) pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮
- DH5α(pSB6A1(promotor less,RFP))を1.5mlエッペンチューブにうつした
- ↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓20℃、14,500rpmで5分間遠心した
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
- ↓溶出液を回収した
- ↓溶出液量に対して酢酸ナトリウムを1/10倍、イソプロパノールを等量加えて混ぜた
- ↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
- ↓上清を捨て、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
- ↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
- ↓上清を捨て、遠心乾燥機で乾燥した
- ↓MilliQを30μl加えた
- (4) AcrABのPCR
- 下表1,2に示した試薬組成、設定に従ってPCRを行った
組成 AcrABM 1.5μL Buffer 5μL dNTPs 5μL KOD-Plus 1μL MgSO4 4μL 鋳型DNA 0.5μL H2O 33μL Total 50μL PCR設定 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60.2℃ 68℃ 68℃ 4℃ 5min 15sec 30sec 20sec 2min ∞ 30サイクル
- (5) pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ
- pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ
- 25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
- ↓電気泳動した
- (6) lacZのアルカリミニプレップ
- 集菌後、水分を十分に取り除き、SolutionⅠ250μLを加えた
- ↓vortexにより混合した後、SolutionⅡ250μLを加え、上下に2，3度転倒させて混ぜた
- ↓SolutionⅢ350μLを加え、よく混合した
- ↓cfg. 25℃ 13,000rpm 5min
- ↓上清をカラムに移した
- ↓cfg. 25℃ 13,000rpm 30sec カラム下部の液を捨てた
- ↓SolutionⅣ500μLを加えた
- ↓cfg. 20℃ 13,000rpm 1min カラム下部の液を捨てた
- ↓SolutionⅤ700μLを加えた
- ↓cfg. 25℃ 13,000rpm 1min×２
- ↓酢酸ナトリウム50μL、イソプロパノール800μLを加えた
- ↓cfg. 25℃ 13,000rpm 10min
- ↓上清を除いた
- ↓70%EtOHをエッペンの8分目まで加えた
- ↓cfg. 25℃ 13,000rpm 5min
- ↓遠心乾燥 2min
- ↓滅菌水100μLに溶かした
Results
- (1) 翌日プレート上で各プラスミドを持つ大腸菌が培養出来ているのを確認した
- (2) 制限酵素処理が上手くいったかどうかは確認できていない
- 翌日以降、電気泳動によって確認し、問題がなければゲル抽出する
- (3) どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である
- 翌日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う
- (4) ゲル抽出をするのに十分な濃度の試料を得ることができた。
- (5) バンドは検出できなかった、iGEMの製作した試薬には問題ありと考えられる
- (6) lacZの吸光度は0,1468（×1/100）でDNA濃度は734g/μLであった
- →冷蔵保存
September 8
Time
- 9：00～
Member
- 岩城、福山、古道、竹内、中村
- Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Nakamura
Purpose
- (1) pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮
- (2) pSB6A1（E0420）の培養
- (3) SodA,OxyR,yaiAのPCR
- (4) PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理
- (5) pSB1C3のイソプロ沈
Method
- (1) pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮
- 4時間ほどLB液体培地で培養した各E.Coliをそれぞれ1.5mlエッペンに8割ほど移した
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓溶出液を回収
- ↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して
- それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
- ↓遠心10分(4℃、14,000rpm)
- ↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。
- ↓遠心5分(4℃、14,000rpm)
- ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
- ↓MilliQを各種プラスミドにつき30μlずつ加えた
- (2) pSB6A1（E0420）の培養
- 前日にAmp入りLB寒天培地にストリークしたpSB6A1(E0420)を
- 2mlのLB液体培地が入った試験管6本に一部うつして
- 振とう培養した
- (3) SodA,OxyR,yaiAのPCR
- プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を
- すでにMixしたプライマー(SodA, OxyR,yaiA)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた
- ↓それぞれのエッペンに下表1の組成で溶液を加えた
- ↓下表2,3のプログラムでPCR反応を行った
- ↓PCR産物を電気泳動にかけた
表1: 試薬組成 テンプレートDNA(DH5α) 各0.5μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus- 5μL 2mM d NTPs 5μL 2mM MgSO4 4μL MilliQ 33μL KOD-Plus- 1μL total 50μL
表2: SodA,OxyRのPCR反応 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 62.7℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 1min 2min 保持 30サイクル 表3: yaiAのPCR反応 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 60.4℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 15sec 30sec 38sec 2min 保持 30サイクル
- (4) PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理
- PCR済のSodA, OxyR,yaiAにそれぞれ200µlずつ滅菌水を加えた
- ↓フェノールクロロホルム(φ OH/CIAA)200µl加えた
- ↓4℃、14,000rpmで10min遠心した
- ↓上清を回収しそれにクロロホルムイソアミルアルコール(CIAA)を200µl加えボルテックスした
- ↓4℃、14,000rpmで10min遠心した
- ↓上清を回収しそれに3M CH3COONaを50µl加え混ぜた
- ↓イソプロパノール0.5ml加えて混ぜ4℃、14,000rpmで20min遠心した
- ↓上澄みを捨て70％エタノール200µl加え4℃、14,000rpmで10min遠心した
- ↓上澄みを捨てて乾燥させた
- ↓滅菌水を30µl加えた
- ↓冷蔵保存した
- (5) pSB1C3のイソプロ沈
- TEに溶かした状態のpSB1C3ベクター50μLに、CH3COONa50μL、イソプロパノール800μLを加えた
- ↓cfg. 25℃ 13,000rpm 15min
- ↓上清を捨てた
- ↓70%EtOH800μLを加えた
- ↓cfg. 25℃ 14,500rpm 5min
- ↓EtOHを除いた
- ↓遠心乾燥 2min
- ↓滅菌水30μLに溶かした
Results
- (1) まだどれほどの量でプラスミドが回収できたのかは分からない
- (2) 培養に成功していれば明日にもアルカリミニプレップを行う予定
- (3) PCR産物を電気泳動にかけた結果、すべて、バンドが検出されたので、今後使用するものとする
- (4) 実験(3)で得られたPCR産物のクロロホルム処理を行い冷蔵保存した
- これを次回の実験に用いる(制限酵素処理など)
- (5)冷蔵保存
September 9
Time
- 9：00～
Member
- 竹内、中村、吉村
- Takeuchi,nakamura,Yoshimura
Purpose
- (1) pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出 [吉村]
- (2) (1)と前日(9/8)にプラスミド抽出した
- pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出 [吉村]
- (3) oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定 [中村]
Method
- (1) pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出
- pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)を1.5mlエッペンチューブにうつした
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓溶出液を回収
- ↓CH3COONaとイソプロパノールを
- 溶出液量に対してそれぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
- ↓遠心10分(4℃、14,000rpm)
- ↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
- ↓遠心5分(4℃、14,000rpm)
- ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
- ↓MilliQを30μl加えた
- (2) pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出
- 今回は青ゲルを使わずにUV照射でバンドの位置を確認してゲル抽出を行う方法をとった
- DNAを下表1,2,3のように制限酵素処理した
- ↓3時間,37℃でインキュベート
- ↓アガロースゲルに下表4の全量をapplyした
- ↓50V,50minで電気泳動した。
- ↓20min EtBrに浸した
- ↓暗室でUVをゲルに照射し、バンドの位置を確認してゲルを切り出した
表1: CFP DNA 40μl EcoRⅠ 1.5μl XbaⅠ 1.5μl M Buffer 5μl milliQ 2μl total 50μl 表2: RFP,YFP DNA 30μl EcoRⅠ 1.5μl XbaⅠ 1.5μl M Buffer 5μl milliQ 12μl total 50μl 表3: TetR DNA 30μl EcoRⅠ 1.5μl PstⅠ 1.5μl H Buffer 5μl milliQ 12μl total 50μl 表4: 試薬組成 Marker(1kb) 3μl Loadiing Buffer 10μl DNA 全量
- (3) oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定
- 冷蔵保存されていたoxyR、sodA、yaiA on pSB6A1をそれぞれ、100倍希釈で吸光度測定した
Results
- (2,3) CFP,YFP,TetRはバンドが見え、切り出しに成功した
- ⇒冷蔵庫に保存、翌日のLigationに使用する
- RFPはバンドが見えなかった
- ⇒ミニプレの必要あり
- (4) oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定結果(100倍希釈)
吸光度 DNA濃度 oxyR 0.018(5回平均) 90ng/μL sodA 0.058(5回平均) 290ng/μL yaiA 0.029(5回平均) 145ng/μL
September 10
Time
- 9：00～
Member
- 福山、竹内、臼井、吉村
- Fukuyama,Takeuchi,Usui,Yoshimura
Purpose
- (1) pSB1A2(I13522),pSB1A2(J04450)の培養 [臼井]
- (2) pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430)とpSB1A2(R0040)のライゲーション [吉村]
- (3) ahpC,sufAの活性確認 [臼井]
- (4) 全プロモーター(予備は除く)の制限酵素処理 [臼井]
- (5) pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ、濃縮 [福山]
- (6) OxyRの逆向きのプロモーター活性を調べるためにInverted LacZをPCRにより作成する [吉村]
Method
- (1) pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450)の培養
- pSB1A2(I13522),pSB1A2(J04450)をマスタープレートより白金耳でひっかき、
- LB(+amp)の培地3mLで各3本ずつ37℃で培養した
- (2) pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430)とpSB1A2(R0040)のライゲーション
- [1] CFP,RFP,YFP,TetR-GFPのDNAのゲルからの抽出
- 切りだしたゲルを入れたエッペンに400μlのmilliQを入れた
- ↓65℃でゲルを溶かした
- ↓フェノールをエッペンの8割くらいまでいれて、vortexした
- ↓14,500rpm,5min,4℃で遠心した
- ↓上清を回収し、フェノールクロロホルムをエッペンの8割くらいまで加えた
- ↓14,500rpm,5min,4℃で遠心した
- ↓上清を回収し、イソプロパノール 800μl,CH3COONa 50μlを加えた
- ↓14,500rpm,10min,4℃で遠心した
- ↓70％EtOH 200μlを加えた
- ↓14,500rpm,3min,4℃で遠心した
- ↓遠心乾燥器にかけた
- ↓30μlのmilliQに溶かした後吸光度を測定しDNA濃度を調べた
- [2] pSB6A2(k121013)とpSB1A2(I13522)のligation
- ligationはT-4ligaseを用いて以下の条件で行った
A(insert:vector=1:2) Insert(TetR-GFP) 1μl Vevtor(pSB6) 7.8μl Buffer 1μl T-4ligase 1μl MilliQ 0μl Total 10.8μl B(insert:vector=1:10) Insert(TetR-GFP) 1μl Vevtor(pSB6) 4.2μl Buffer 1μl T-4ligase 1μl MilliQ 3μl Total 10μl
- A、B両サンプルをそれぞれ16℃で1時間インキュベートした
- 以上の2サンプルについては以下の条件でトランスフォーメーションを行った
- DH5α50μlに以上の2サンプル全量を加え混ぜた後、30分間氷上で静置した
- ↓43℃で40秒インキュベートした後、10分間氷上で静置した
- ↓この各サンプルをLBプレート(+amp 終濃度50μg/ml)にまき37℃でインキュベートした(overnight)
- (3) ahpC,sufAの活性確認
- ahpC,sufAに関して100倍希釈の吸光度5回測定し、平均値より各濃度を算出した
ahpC 1回目 0.211 2回目 0.210 3回目 0.204 4回目 0.200 5回目 0.198 Ave 0.2046 濃度1023ng/μL sufA 1回目 0.161 2回目 0.164 3回目 0.165 4回目 0.160 5回目 0.159 Ave 0.1618 濃度809ng/μL
- (4) 全プロモーター(予備は除く)の制限酵素処理
- ahpC(全量240μL),AcrAB(全量45μL),dps(全量195μL),SodA(全量135μL),
- sufA(全量240μL),oxyR(全量45μL),yaiA(全量135μL)の七種類のプロモーターに関して、
- 濃縮を以下の手順で行い、制限酵素処理を行った
- [濃縮]
- DNA溶液の全量をxμLとして、DNA溶液に1/10x μL 3M CH3COONa,x μL isopropanolを加えた
- ↓cfg.14000rpm,20min,4℃
- ↓上清を捨て、70%EtOHを加えた
- ↓cfg.14000rpm,10min,4℃
- ↓上清を捨て遠心乾燥 30sec.
- ↓それぞれのDNAにH2O 30μLを加えた
- [制限酵素処理]
＜組成＞ DNAサンプル 30μL 10×H-Buffer 4μL(1×として使用) EcoRⅠ 0.4μL SpeⅠ 0.2μL H2O 5.4μL Total 40μL
- これを37℃,overnightで培養した
- (5) pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ、濃縮
- pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)を
- それぞれ別々に1.5mlエッペンチューブにうつした
- ↓遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓溶出液を回収
- ↓CH3COONaとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
- ↓遠心10分(4℃、14,000rpm)
- ↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
- ↓遠心5分(4℃、14,000rpm)
- ↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
- ↓TE(10μlTris-HCl pH8.0/1mM EDTA)をそれぞれ30μlずつ加え、冷蔵庫で保管した
- (6) OxyRの逆向きのプロモーター活性を調べるためにInverted LacZをPCRにより作成する
- [1]Inverted LacZ 作成のためのPCR
- 鋳型DNAとしてiGEMで登録されているpSB1A2(I732019)を用いた
- PCRの条件は以下の条件で行った
Sample A 鋳型DNA(810ng/ul) 0.5ul MgSO4 1ul dNTP 2ul KODplus 0.5ul Primer(forward) 0.5ul Primer(Reverse) 0.5ul Buffer 2ul MilliQ 13ul Total 20ul Sample B 鋳型DNA(810ng/ul) 0.5ul MgSO4 2ul dNTP 2ul KODplus 0.5ul Primer(forward) 0.5ul Primer(Reverse) 0.5ul Buffer 2ul MilliQ 12ul Total 20ul PCR反応 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 63℃ 75℃ 75/TD> 4℃ 2min 30sec 30sec 30sec 10min 保持 35サイクル
- 合成したプライマーを以下に示した
Primer(forward) 5’-CAGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGTATAAACGCAGAAAGGCCCA Primer(Reverse) 5’-ACGTACTAGTAGCGGCCGCTGCAGAAAGAGGAGAAATACTAGAT
- 以上の条件によりPCRで増幅させたサンプルを電気泳動し、増幅の確認を行った
Results
- (1) 翌日、培養の成功を確認した
- (2) それぞれのDNA濃度を以下にまとめた
- CFP 280ng/μl
- YFP 450ng/μl
- TetR－GFP 400ng/μl
- 翌日コロニーができていた
- (3) 濃度の測定で十分量と判断し、以後の実験に使用した
- (4) 翌日11日に結果記載
- (5) どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である
- 明日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う
- (6) Ⅰのサンプルではバンドがみられなかったが、Ⅱのサンプルではバンドが見えた
- ⇒Ⅱのサンプルでバンドが見られたことから、次回からPCRするにはⅡの条件で行うのがよい
- TetR-GFPのインサートが937bpなので、今回得られたバンドは少しそれより長いものと考えられる
- 急ぎなのでこのまま使用するが、本来ならカットチェックを行う必要がある
September 11
Time
- 9：00～
Member
- 福山、古道、竹内、臼井、革島、中村
- Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Kawashima,Nakamura
Purpose
- (1) ライゲーション済TetR・GFPのピックアップ、ミニプレップ [竹内]
- (2) ライゲーション済TetR・GFPのストリーク [古道]
- (3) PoxyR(GFPあり、onpsB6A1)の培養6本→アルカリミニプレップ→制限酵素処理(over night) [臼井]
- (4) LacZ(inverted)のPCR2本、35サイクル→制限酵素処理(over night) [竹内]
- (5) Promoterのゲル抽出(全種類) [古道]
- (6) プロモーターレスLacZの ミニプレ→制限酵素処理 [竹内]
- (7) pSB1A2 I13522、pSB6A1 K121013、pSB6 TetR-GFPのプレカルチャー [革島]
- (8) 前日にアルカリミニプレップした
- pSB6A1(BBa_J04450,RFP),pSB6A1(BBa_I13507,RFP,promoter less),pSB1A2(BBa_I13522,TetR)
- の吸光度の測定と制限酵素処理 [革島]
- (9) pSB6A1(BBa_K121013:OxyR,GFP)のアルカリミニプレップ [福山]
- (10) AcrAB,SodA,sufA,ahpC,oxyR,yaiA,dpsの電気泳動 [福山]
- (11) SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのゲル抽出 [臼井]
- (12) SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのライゲーション [臼井]
Method
- (1) ライゲーション済TetR・GFPのピックアップ、ミニプレップ
- ライゲーション済TetR・GFPをピックアップした
- ↓4時間程37℃振とう培養した
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓溶出液を回収
- (2) ライゲーション済TetR・GFPのストリーク
- amp入りLBプレートにライゲーション済TetR・GFPをストリークした
- (3) PoxyR(GFPあり、onpsB6A1)の培養6本→アルカリミニプレップ→制限酵素処理(over night)
- 試験管で培養した試料をカラムなしのミニプレ処理を行いDNAを抽出した
- そして、抽出後の試料にEcoRⅠ,PstⅠでの制限酵素処理を行った
- 組成を下表1に示した
表1: 制限酵素処理組成 DNAsol 3μL EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL 10×H 5μL H2O 40μL Total 50μL
- (4) LacZ(inverted)のPCR2本、35サイクル→制限酵素処理(over night)
- Inverted lacZのPrimer(forward)1.5μl、Primer(Revese)1.5μlを500μlエッペンに分注した
- ↓それぞれのエッペンに下表2の組成で溶液を加えた
- ↓下表3に示したプログラムでPCR反応を行った
- ↓PCR済のInverted lacZの吸光度測定し、DNA濃度を算出した
- ↓下表4の組成でエッペンに分注し、制限酵素処理を行った
- ↓これを37℃でインキュベートした(overnihgt)
表2: 試薬組成 pSB1A2(BBa-I732019) 各 1μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus- 5μL 2mM d NTPs 5μL 2mM MgSO4 4μL MilliQ 31μL KOD-Plus- 1μL PCR反応 熱変性 熱変性 アニーリング 伸長反応 伸長反応 保存 94℃ 94℃ 63℃ 75℃ 75℃ 4℃ 2min 30sec 30sec 30sec 10min 保持 35サイクル 表4: 制限酵素処理 PCR済Inverted lacZ A B DNA 40μl 40μl EcoRⅠ 1.796μl 0.94μl SpeⅠ 0.997μl 0.522μl Buffer H 5μl 5μl Milli Q 2.207μl 3.538μl total 50μl 50μl
- (5) Promoterのゲル抽出(全種類)
AcrAB,ahpC,dps,oxyR,,SodA,sufA,yaiA過酸化水素応答性プロモーター7種類に対して カラムを使わないゲル抽出を行った
- (6) プロモーターレスLacZの ミニプレ→制限酵素処理
- 遠心1分(20℃、14,000rpm)して集菌(菌液を使いきるまで)
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、よくボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心5分(20℃、14,000rpm)
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,000rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓溶出液を回収
- プロモーターレスLacZの制限酵素処理
- EcoRⅠ、pstⅠでカット。Total50μL
- (7) pSB1A2 I13522、pSB6A1 K121013、pSB6 TetR-GFPのプレカルチャー
- プレートを4分割してそれぞれをストリーク、1つはNothingとした
- ↓37℃でインキュベートした(over night)
- (8) pSB6A1(BBa_J04450,RFP),pSB6A1(BBa_I13507,RFP,promoter less),pSB1A2(BBa_I13522,TetR)
- の吸光度の測定と制限酵素処理
- 前日にアルカリモニプレップと濃縮を終えていた3試料を100倍希釈して吸光度(260nm)を測定した
試料A pSB6A1(BBa_J04450,RFP) 試料B pSB6A1(BBa_I13507,RFP,promoter less) 試料C pSB1A2(BBa_I13522,TetR)
- ↓下表5に従い試料を調整した
- ↓37℃でインキュベート
表5: 試薬組成 試料B(μl) 試料C(μl) DNA溶液 29 29 EcoRⅠ 0.15 0.8 SpeⅠ 0.085 XbaⅠ 0.89 Buffer H 5 5 Milli Q 15.8 14.31 合計 約50 約50
- (9) pSB6A1(BBa_K121013:OxyR,GFP)のアルカリミニプレップ
- 遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
- ↓上清を捨てた
- ↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
- ↓SolutionⅡを250μl加えた
- ↓SolutionⅢを350μl加えた
- ↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
- ↓上清をカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
- ↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓抽出液を捨てた
- ↓滅菌水100μlをカラムに入れた
- ↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
- ↓溶出液を回収した
- (10) AcrAB,SodA,sufA,ahpC,oxyR,yaiA,dpsの電気泳動
- 前日(10日)にEcoRⅠ-SpeⅠでカットしておいた
- AcrAB,SodA,sufA,ahpC,oxyR,yaiA,dpsの七種類のプロモーターに関して
- 1%アガロースゲル(ゲル抽出用)で50V-45minの条件で電気泳動を行った
- (11) SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのゲル抽出
- ＜方法＞
- 抽出(QIAGENのQIAquick®Gel Extraction kit(250)を使用)
- 切りだしたゲルの重さを事前に量った
- ↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート
- ↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
- ↓cfg.10,000rpm-1min
- ↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた。
- ↓cfg.10,000rpm-1min
- ↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた。
- ↓cfg.10,000rpm-1min
- ↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた。
- ↓cfg.10,000rpm-1min
- ↓内5μLを濃度測定に使用した(H2Oを95μL加え20倍希釈とした)
- (12) SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのライゲーション
- CFP-On pSB6(ローコピーベクター)、各種プロモーターおよび、
- YFP-On pSB6(ローコピーベクター)、各種プロモーターのligation
- ligationはT-4lagaseを用いligation条件を以下の条件で行った
- CFP-on pSB6,各種プロモーターのligation
- [Ⅰ] insert:vector=1:2
|
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| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
- YFP on pSB6,各種プロモーターのligation
- [Ⅰ] insert:vector=1:2
| Insert(sufA) | 6μl |
| Vevtor(CFP-On pSB6) | 1.8μl |
| Buffer | 1μl |
| T-4ligase | 0.8μl |
| Milli Q | 0.4μl |
| Total | 10μl |
| Insert(sodA) | 6μl |
| Vevtor(CFP-On pSB6) | 0.8μl |
| Buffer | 1μl |
| T-4ligase | 0.8μl |
| Milli Q | 1.4μl |
| Total | 10μl |
| Insert(ahpC) | 6μl |
| Vevtor(CFP-On pSB6) | 1.9μl |
| Buffer | 1μl |
| T-4ligase | 0.8μl |
| Milli Q | 0.3μl |
| Total | 10μl |
Insert (oxyR) 5μl
Vevtor (CFP-On pSB6) 2.5μl
Buffer 1μl
T-4ligase 0.8μl
MilliQ 0.7μl
Total 10μl
Insent (dps) 5μl
Vevtor (CFP-On pSB6) 2.7μl
Buffer 1μl
T-4ligase 0.8μl
MilliQ 0.5μl
Total 10μl
CFP-on pSB6,各種プロモーターのligation
Ⅱ(insert:vector=1:5)
Insert (sufA) 5μl
Vevtor (CFP-On pSB6) 1μl
Buffer 1μl
T-4ligase 0.8μl
MilliQ 2.2μl
Total 10μl
Insert (sodA) 5μl
Vevtor (CFP-On pSB6) 0.4μl
Buffer 1μl
T-4ligase 0.8μl
MilliQ 2.8μl
Total 10μl
Insert (ahpC) 6μl
Vevtor (CFP-On pSB6) 1μl
Buffer 1μl
T-4ligase 0.8μl
MilliQ 1.2μl
Total 10μl
Insert (oxyR) 5μl
Vevtor (CFP-On pSB6) 1.4μl
Buffer 1μl
T-4ligase 0.8μl
MilliQ 2.8μl
Total 10μl
Insent (dps) 5μl
Vevtor (CFP-On pSB6) 1.5μl
Buffer 1μl
T-4ligase 0.8μl
MilliQ 2.7μl
Total 10μl
YFP-on pSB6,各種プロモーターのligation
Ⅱ(insert:vector=1:5)
Insert (sufA) 5μl
Vevtor (CFP-On pSB6) 0.6μl
Buffer 1μl
T-4ligase 0.8μl
MilliQ 2.6μl
Total 10μl
Insert (sodA) 5μl
Vevtor (CFP-On pSB6) 0.3μl
Buffer 1μl
T-4ligase 0.8μl
MilliQ 2.9μl
Total 10μl
Insert (ahpC) 5μl
Vevtor (CFP-On pSB6) 0.6μl
Buffer 1μl
T-4ligase 0.8μl
MilliQ 2.6μl
Total 10μl
Insert (oxyR) 5μl
Vevtor (CFP-On pSB6) 0.85μl
Buffer 1μl
T-4ligase 0.8μl
MilliQ 2.35μl
Total 10μl
Insent (dps) 5μl
Vevtor (CFP-On pSB6) 0.9μl
Buffer 1μl
T-4ligase 0.8μl
MilliQ 2.3μl
Total 10μl
以上の条件で作成したすべてのサンプルについてトランスフォーメーションを行い大腸菌に形質転換させた。
DH5α50μlに以上のサンプル全量をそれぞれ加え混ぜた後、3min氷上で静置した。
↓
４３℃で３０秒インキュベートした後、１０分間氷上で静置した。
↓
この各サンプルをLBプレート（アンピシリン 終濃度５０μg/ml）にまき３７℃でインキュベートした。（overnight）
【実験結果】 (1)ライゲーション済TetR・GFPのミニプレップ処理後は保存し、次回吸光度測定をした。 (2)翌日生えていた。
（3）1％アガロースゲル 5枚作成
（4）切り出し用ゲル 4枚作成
(5) 以後ゲルの切り出しで使用。
※作成したEtBrは使うごとに、「正」の文字を一画足す。 5回切り出しを行ったEtBrは染色用とする。
(6)十分な量のDNAを抽出できたので予定通り、制限酵素処理を行った。
(7)
PCR済のInverted lacZ①吸光度(100倍希釈)
0.094 0.090 0.089 0.091 0.085
平均 0.0898 DNA濃度：0.0898×100×50＝4.49×10²(µl/ml) PCR済のInverted lacZ①吸光度(100倍希釈)
0.050 0.046 0.048 0.050 0.041
平均 0.0470 DNA濃度：0.0470×100×50＝2.35×10²(µl/ml)
制限酵素処理後はDNA抽出を行う。
(8)AcrAB,ahpC,dps,oxyR,,SodA,sufA,yaiAのうちAcrAB,ahpC,sufAがゲル抽出に成功した。
ゲル抽出に成功した試料の濃度は以下の通り
AcrAB ahpC sufA 濃度 28 ng/μL 1238 ng/μL 640 ng/μL
(9) プロモーターレスLacZの ミニプレ
Sample1(1/20) Sample2(1/20) Sample3(1/200) OD260 0.546 0.210 0.072 DNA量 546ng/μL 210ng/μL 720ng/μL 全量 90μL 95μL 50μL
(10)
翌日生えていた。
(11) 吸光度（260nm）の測定結果を示す
試料A 試料Ｂ 試料Ｃ
0.004 0.01 0.057
0.002 0.01 0.05
0.007 0.01 0.053
0.01 0.011 0.054
0.004 0.011 0.062
平均 0.0054 0.0104 0.0552
試料A;pSB1A2(BBa_I13522,TetR)→非常に薄くて使えないことが分かったので破棄
試料B;ｐSB6A1(BBa_J04450,RFP)→薄かったけれどとりあえず制限酵素処理をした
試料C;pSB6A1(BBa_I13507,RFP,promoter less)→薄かったけれどとりあえず制限酵素処理をした
(12)
まだ濃度が分からない状態。あす以降に吸光度を測定する。
(13)
AcrABはゲル抽出が可能な量を得られなかった。これはPCRがうまくいっていなかったと考えられる。また、yaiAはアガロースゲルのコームが貫通していたため溶液が流れ出てしまい、ゲル抽出が不可能だった。
残りの五つに関しては十分量得られたのでゲル抽出に移った。
(14)
各DNA濃度
・SodA
1 ; 0.021
2 ; 0.021
3 ; 0.022
4 ; 0.030
5 ; 0.022
Ave ; 0.0232
・sufA
1 ; 0.052
2 ; 0.060
3 ; 0.053
4 ; 0.052
5 ; 0.052
Ave ; 0.0538
・ahpC
1 ; 0.055
2 ; 0.053
3 ; 0.055
4 ; 0.055
5 ; 0.056
Ave ; 0.0548
・oxyR
1 ; 0.077
2 ; 0.078
3 ; 0.078
4 ; 0.071
5 ; 0.077
Ave ; 0.0762
・dps
1 ; 0.072
2 ; 0.093
3 ; 0.091
4 ; 0.080
5 ; 0.074
Ave ; 0.082
(15)
次の日(12日)にコロニーがはえていた。
コロニー数は非常に少ない。これは時間の関係上回復培養を行っていなったためでると考えられる。
【考察】 (8)4つの試料のゲル抽出が成功しなかったのはミニプレ後の試料のDNA濃度が不十分であったためであると考えられる。
