Template:KIT-Kyoto-week5

From 2010.igem.org

(Difference between revisions)

Revision as of 07:14, 4 October 2010

September 5

>>top

Time

9：30～

Member

岩城、竹内、吉村

Iwaki,Takeuchi,Yoshimura

Purpose

(1)　前日にシングルコロニーピックアップをしたpSB1C3(J04450)を

制限酵素処理を行うことにより、目的プラスミドの挿入を確認した

(2)　プロモーター挿入用のpSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507)

インサートを切り出してI13507の挿入用のpSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出

(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション

Method

(1)　pSB1C3のプラスミド抽出と制限酵素処理による確認

　前日に2つのシングルコロニーをピックアップし2 mlのLB培地(+Cam)で37℃で一晩培養した

　↓1.5 mlをチューブに採った

　↓25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓カラムを新しいチューブに乗せ換えた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　それぞれ10 µlを別のチューブに採った

　↓H bufferを5 µl加えた

　↓蒸留水を34 µl加えた

　↓EcoRⅠとPstⅠを0.5 µlずつ加えた

　↓37℃で1.5時間インキュベートした

　↓1 %ゲルを用いて、100 Vで25分間電気泳動した

　↓20分間EtBrで染色した

　↓紫外線を照射し写真を撮影した

(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出

　PCR用のpSB6A1,RFP,pSB6A1を右表1,2の組成で平常通り制限酵素処理した

　↓右表3,4の組成でゲルにアプライした

　↓50Vで30分間電気泳動した

　↓UVを照射してゲルを切り出した

　↓H2O　400μLを加えた

　↓65℃　40minでヒートブロック

　↓Phe等量加えて　vortex

　↓cfg.　14500rpm　5min　25℃

　↓上清を新チューブへ

　↓Phe/Chl等量　voltex　　

　↓cfg. 14500rpm　5min　25℃

　↓上清を新チューブへ

　↓3M CH₃COONa　50μLを加えた

　↓イソプロ　800μLを加えた

　↓cfg.　14500rpm　10min　4℃

　↓上清除き、70％EtOH 150μL

　↓cfg.　14500rpm 5min 4℃

　↓遠心乾燥機　5min

　↓MilliQ　10μLを加えた

表1: PCR用pSB6A1
DNAsol	262μL
EcoRⅠ	4μL
XbaⅠ	4μL
Buffer M	30μL
total	300μL

表2: RFP,pSB6A1
DNAsol	85μL
EcoRⅠ	2.5μL
PstⅠ	2.5μL
Buffer H	10μL
total	100μL

表3: PCR用のpSB6A1
DNA	300μl
Orange Loading Dye	50μl

表4: RFP,pSB6A1
DNA	100μl
Orange Loading Dye	20μl

(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション

　コンピテントセルにDNAを入れた

　↓20分間氷冷した

　↓43℃のウォーターバスに45秒間いれた

　↓5分間氷冷した

　↓SOC培地を900μl加えた

　↓20分間,37℃のインキュベーターに入れた

　↓13000rpm,4℃,1分間遠心した

　↓培養液を少し捨て量を減らし、ピペッティングした

　LBプレートにまき、37℃のインキュベーターに入れてovernight

Results

(1)　以下のようにサンプルを泳動した

レーン1	1Kb Maker
レーン2	コロニー1から抽出したプラスミド
レーン3	コロニー1から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの
レーン4	コロニー2から抽出したプラスミド
レーン5	コロニー2から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの

レーン2と4で同じ長さのバンドが確認できた

またレーン3と5では2本のバンドが確認でき、3と5で長さに違いはなかった

(2)　RFPのバンドが見られなかった

(3)　全てのプレートでコロニーの生育が見られた

Consideration

(1)　pSB1C3はベクター2072bp・インサート1069bpであり、

インサート部分の両端に今回使用した制限酵素で切断できる部位をもつので

電気泳動の結果と照らし合わせるとどちらのコロニーも目的プラスミドの挿入がなされていると考えられる

これを用いてマスタープレート・グリセロールストックの作成をする

(2)　制限酵素処理に失敗したと思われる

September 6

>>top

Time

8:30～20:30

Member

岩城

Iwaki

Purpose

(1)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のプラスミドを抽出する

(2)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)を制限酵素処理する

(3)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のゲル抽出

(4)　RFP・CFP・YFPをpSB1A2からpSB6A1に乗せ換える

AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターをpSB6A1(K121013)のRBSの前に挿入する

Method

(1)　プラスミド抽出

　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)の

　4種のプラスミドの抽出をした(カラムを使用したミニプレップ)

(2)　制限酵素処理

　(1)で抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した

　(1)で抽出したpSB6A1(K121013)を2つに分け、RFP,CFP,YFP用とpromoter用とした

　RFP,CFP.YFP用をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した

　promoter用をEcoRⅠとXbaⅠの2種の制限酵素で切断した

(3)　ゲル抽出

　(2)で制限酵素処理したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の

　インサートと pSB6A1(K121013)のベクターのゲル抽出を行った(青ゲル)

(4)　LigationとTrans formation

　(3)でゲル抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の

　インサートと pSB6A1(K121013)(RFP,CFP,YFP用)のLigationを行った

　前日にゲル抽出済みの AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターと

　(3)でゲル抽出したpSB6A1(K121013)(promoter用)のLigationを行った　

　LigationしたものをTFして、プレートを37℃・overnightでインキュベートした

Results

ゲル抽出の際にpSB1A2(I13507)のバンドが確認できなかったため抽出できなかった

それ以外に関してはTFまで完了した

以下の計5種

　　pSB6A1(E0430)

　　pSB6A1(E0420)

　　pSB6A1(K362007)

　　pSB6A1(K362011)

　　pSB6A1(K362013)

Consideration

試験管3本分ではゲル抽出でバンドがでない可能性が高い

確実にゲル抽出するためには5本以上の試験管での培養が必要と考えられる

September 7

>>top

Time

9：00～

Member

岩城、福山、竹内、中村

Iwaki,fukuyama,Takeuchi,Nakamura

Purpose

(1)　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP)),DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP)),

DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP)),DH5α(pSB6A1(SodA,GFP)),

DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))のコロニーをピックアップ [福山]

(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理　[福山]

(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮　[福山]

(4)　AcrABのPCR　[中村]

(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ

(6)　lacZのアルカリミニプレップ

Method

(1)　コロニーをピックアップ

　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP))

　DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP))

　DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP))

　DH5α(pSB6A1(SodA,GFP))

　DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))

　それぞれのコロニーを32個ずつピックアップし、LBプレート(+amp)にストリークした

　↓37℃でインキュベートした

(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理

　PCR処理済みのAcrAB溶液400μlにMilliQ200μl加えた

　↓フェノールクロロホルム溶液を1.2mlほど加えてピペッティングし、vortexした

　↓室温、14,500rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収し、これに2-プロパノールを1.2mlほど加えた

　↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨て、70％エタノールを1.2mlほど加えた

　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した

　↓上清を捨てた

　↓遠心乾燥機で乾燥した

　↓MilliQを30μl加えた

　↓5μlとって2％アガロースゲル電気泳動で確認した(300bpあたりにバンドが見えた)

　↓100倍希釈で吸光度を計測した

　↓濃縮したプラスミド溶液24μlに下表2に従い各試薬を加えた

　↓調整した試料を37℃で一晩インキュベートした

表1: 吸光度計測結果
AD₂₆₀	0.071
	0.069
	0.069
	0.07
	0.071
平均	0.07

表2: 試薬組成
AcrAB	24μl
EcoRⅠ	0.84μl
PstⅠ	0.933μl
H Buffer	2.6μl
MilliQ	21.6μl
全量	約50μl

(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮

　DH5α(pSB6A1(promotor less,RFP))を1.5mlエッペンチューブにうつした

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓20℃、14,500rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を回収した

　↓溶出液量に対して酢酸ナトリウムを1/10倍、イソプロパノールを等量加えて混ぜた

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨て、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した

　↓上清を捨て、遠心乾燥機で乾燥した

　↓MilliQを30μl加えた

(4)　AcrABのPCR

　下表1,2に示した試薬組成、設定に従ってPCRを行った

組成
AcrABM	1.5μL
Buffer	5μL
dNTPs	5μL
KOD-Plus	1μL
MgSO₄	4μL
鋳型DNA	0.5μL
H₂O	33μL
Total	50μL

PCR設定
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	60.2℃	68℃	68℃	4℃
5min	15sec	30sec	20sec	2min	∞
	30サイクル

(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ

　pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ

　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓電気泳動した

(6)　lacZのアルカリミニプレップ

　集菌後、水分を十分に取り除き、SolutionⅠ250μLを加えた

　↓vortexにより混合した後、SolutionⅡ250μLを加え、上下に2，3度転倒させて混ぜた

　↓SolutionⅢ350μLを加え、よく混合した

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min

　↓上清をカラムに移した

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　30sec　カラム下部の液を捨てた

　↓SolutionⅣ500μLを加えた

　↓cfg.　20℃　13,000rpm　1min　カラム下部の液を捨てた

　↓SolutionⅤ700μLを加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　1min×２

　↓酢酸ナトリウム50μL、イソプロパノール800μLを加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　10min

　↓上清を除いた

　↓70%EtOHをエッペンの8分目まで加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min

　↓遠心乾燥　2min

　↓滅菌水100μLに溶かした

Results

(1)　翌日プレート上で各プラスミドを持つ大腸菌が培養出来ているのを確認した

(2)　制限酵素処理が上手くいったかどうかは確認できていない

翌日以降、電気泳動によって確認し、問題がなければゲル抽出する

(3)　どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である

翌日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う

(4)　ゲル抽出をするのに十分な濃度の試料を得ることができた。

(5)　バンドは検出できなかった、iGEMの製作した試薬には問題ありと考えられる

(6)　lacZの吸光度は0,1468（×1/100）でDNA濃度は734g/μLであった

　　　→冷蔵保存

September 8

>>top

September 9

>>top

September 10

>>top

September 11

>>top

@@ Line 208: / Line 208: @@
 == September 7 ==
 <div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
-【時間】
+'''Time'''
 :9：00～
-【実験担当】
+'''Member'''
-:岩城、竹内、中村、福山
+:岩城、福山、竹内、中村
+:Iwaki,fukuyama,Takeuchi,Nakamura
-【実験目的】
+'''Purpose'''
 :(1)　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP)),DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP)),
 ::DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP)),DH5α(pSB6A1(SodA,GFP)),
-::DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))のコロニーをピックアップ
+::DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))のコロニーをピックアップ [福山]
-:(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理
+:(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理　[福山]
-:(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮
+:(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮　[福山]
+:(4)　AcrABのPCR　[中村]
+:(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ
+:(6)　lacZのアルカリミニプレップ
-【実験内容】
+'''Method'''
 :(1)　コロニーをピックアップ
 ::　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP))
@@ Line 249: / Line 253: @@
 ::<TABLE BORDER="0"><TR>
 ::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
-::<TD COLSPAN="2">＜表1＞吸光度計測結果</TD></TR>
+::<TD COLSPAN="2">表1: 吸光度計測結果</TD></TR>
 ::<TR>
 ::<TD ROWSPAN="5">AD<SUB>260</SUB></TD><TD>0.071</TD></TR>
@@ Line 265: / Line 269: @@
 ::<TD></TD><TD></TD>
 ::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
-::<TD COLSPAN="2">＜表2＞試薬組成</TD></TR>
+::<TD COLSPAN="2">表2: 試薬組成</TD></TR>
 ::<TR>
 ::<TD>AcrAB</TD><TD>24μl</TD></TR>
@@ Line 311: / Line 315: @@
 ::　↓MilliQを30μl加えた
-【結果】
+:(4)　AcrABのPCR
+::　下表1,2に示した試薬組成、設定に従ってPCRを行った
+::<TABLE BORDER="0"><TR>
+::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
+::<TD>組成</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>AcrABM</TD><TD>1.5μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>Buffer</TD><TD>5μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>dNTPs</TD><TD>5μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>KOD-Plus</TD><TD>1μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>MgSO<SUB>4</SUB></TD><TD>4μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>鋳型DNA</TD><TD>0.5μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>33μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>Total</TD><TD>50μL</TD></TR>
+::</TABLE></TD>
+::<TD></TD><TD></TD>
+::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
+::<TD COLSPAN="2">PCR設定</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>熱変性</TD><TD>熱変性</TD><TD>アニーリング</TD><TD>伸長反応</TD><TD>伸長反応</TD><TD>保存</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>94℃</TD><TD>94℃</TD><TD>60.2℃</TD><TD>68℃</TD><TD>68℃</TD><TD>4℃</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>5min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>20sec</TD><TD>2min</TD><TD>∞</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD></TD><TD COLSPAN="3"><CENTER>30サイクル</CENTER></TD><TD></TD><TD></TD></TR>
+::</TABLE>
+::</TD></TR></TABLE>
+:(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ
+::　pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ
+::　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
+::　↓上清を捨てた
+::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
+::　↓SolutionⅡを250μl加えた
+::　↓SolutionⅢを350μl加えた
+::　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
+::　↓上清をカラムに入れた
+::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
+::　↓抽出液を捨てた
+::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
+::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
+::　↓抽出液を捨てた
+::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
+::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
+::　↓抽出液を捨てた
+::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
+::　↓抽出液を捨てた
+::　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
+::　↓電気泳動した
+:(6)　lacZのアルカリミニプレップ
+::　集菌後、水分を十分に取り除き、SolutionⅠ250μLを加えた
+::　↓vortexにより混合した後、SolutionⅡ250μLを加え、上下に2，3度転倒させて混ぜた
+::　↓SolutionⅢ350μLを加え、よく混合した
+::　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min
+::　↓上清をカラムに移した
+::　↓cfg.　25℃　13,000rpm　30sec　カラム下部の液を捨てた
+::　↓SolutionⅣ500μLを加えた
+::　↓cfg.　20℃　13,000rpm　1min　カラム下部の液を捨てた
+::　↓SolutionⅤ700μLを加えた
+::　↓cfg.　25℃　13,000rpm　1min×２
+::　↓酢酸ナトリウム50μL、イソプロパノール800μLを加えた
+::　↓cfg.　25℃　13,000rpm　10min
+::　↓上清を除いた
+::　↓70%EtOHをエッペンの8分目まで加えた
+::　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min
+::　↓遠心乾燥　2min
+::　↓滅菌水100μLに溶かした
+'''Results'''
 :(1)　翌日プレート上で各プラスミドを持つ大腸菌が培養出来ているのを確認した
 :(2)　制限酵素処理が上手くいったかどうかは確認できていない
@@ Line 317: / Line 398: @@
 :(3)　どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である
 ::翌日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う
+:(4)　ゲル抽出をするのに十分な濃度の試料を得ることができた。
+:(5)　バンドは検出できなかった、iGEMの製作した試薬には問題ありと考えられる
+:(6)　lacZの吸光度は0,1468（×1/100）でDNA濃度は734g/μLであった
+::　　　→冷蔵保存
 == September 8 ==

Template:KIT-Kyoto-week5

From 2010.igem.org

Revision as of 07:14, 4 October 2010

Contents

September 5

September 6

September 7

September 8

September 9

September 10

September 11