Template:KIT-Kyoto-week5

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Revision as of 06:57, 4 October 2010

September 5

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Time

9：30～

Member

岩城、竹内、吉村

Iwaki,Takeuchi,Yoshimura

Purpose

(1)　前日にシングルコロニーピックアップをしたpSB1C3(J04450)を

制限酵素処理を行うことにより、目的プラスミドの挿入を確認した

(2)　プロモーター挿入用のpSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507)

インサートを切り出してI13507の挿入用のpSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出

(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション

Method

(1)　pSB1C3のプラスミド抽出と制限酵素処理による確認

　前日に2つのシングルコロニーをピックアップし2 mlのLB培地(+Cam)で37℃で一晩培養した

　↓1.5 mlをチューブに採った

　↓25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓カラムを新しいチューブに乗せ換えた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　それぞれ10 µlを別のチューブに採った

　↓H bufferを5 µl加えた

　↓蒸留水を34 µl加えた

　↓EcoRⅠとPstⅠを0.5 µlずつ加えた

　↓37℃で1.5時間インキュベートした

　↓1 %ゲルを用いて、100 Vで25分間電気泳動した

　↓20分間EtBrで染色した

　↓紫外線を照射し写真を撮影した

(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出

　PCR用のpSB6A1,RFP,pSB6A1を右表1,2の組成で平常通り制限酵素処理した

　↓右表3,4の組成でゲルにアプライした

　↓50Vで30分間電気泳動した

　↓UVを照射してゲルを切り出した

　↓H2O　400μLを加えた

　↓65℃　40minでヒートブロック

　↓Phe等量加えて　vortex

　↓cfg.　14500rpm　5min　25℃

　↓上清を新チューブへ

　↓Phe/Chl等量　voltex　　

　↓cfg. 14500rpm　5min　25℃

　↓上清を新チューブへ

　↓3M CH₃COONa　50μLを加えた

　↓イソプロ　800μLを加えた

　↓cfg.　14500rpm　10min　4℃

　↓上清除き、70％EtOH 150μL

　↓cfg.　14500rpm 5min 4℃

　↓遠心乾燥機　5min

　↓MilliQ　10μLを加えた

表1: PCR用pSB6A1
DNAsol	262μL
EcoRⅠ	4μL
XbaⅠ	4μL
Buffer M	30μL
total	300μL

表2: RFP,pSB6A1
DNAsol	85μL
EcoRⅠ	2.5μL
PstⅠ	2.5μL
Buffer H	10μL
total	100μL

表3: PCR用のpSB6A1
DNA	300μl
Orange Loading Dye	50μl

表4: RFP,pSB6A1
DNA	100μl
Orange Loading Dye	20μl

(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション

　コンピテントセルにDNAを入れた

　↓20分間氷冷した

　↓43℃のウォーターバスに45秒間いれた

　↓5分間氷冷した

　↓SOC培地を900μl加えた

　↓20分間,37℃のインキュベーターに入れた

　↓13000rpm,4℃,1分間遠心した

　↓培養液を少し捨て量を減らし、ピペッティングした

　LBプレートにまき、37℃のインキュベーターに入れてovernight

Results

(1)　以下のようにサンプルを泳動した

レーン1	1Kb Maker
レーン2	コロニー1から抽出したプラスミド
レーン3	コロニー1から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの
レーン4	コロニー2から抽出したプラスミド
レーン5	コロニー2から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの

レーン2と4で同じ長さのバンドが確認できた

またレーン3と5では2本のバンドが確認でき、3と5で長さに違いはなかった

(2)　RFPのバンドが見られなかった

(3)　全てのプレートでコロニーの生育が見られた

Consideration

(1)　pSB1C3はベクター2072bp・インサート1069bpであり、

インサート部分の両端に今回使用した制限酵素で切断できる部位をもつので

電気泳動の結果と照らし合わせるとどちらのコロニーも目的プラスミドの挿入がなされていると考えられる

これを用いてマスタープレート・グリセロールストックの作成をする

(2)　制限酵素処理に失敗したと思われる

September 6

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Time

8:30～20:30

Member

岩城

Iwaki

Purpose

(1)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のプラスミドを抽出する

(2)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)を制限酵素処理する

(3)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のゲル抽出

(4)　RFP・CFP・YFPをpSB1A2からpSB6A1に乗せ換える

AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターをpSB6A1(K121013)のRBSの前に挿入する

Method

(1)　プラスミド抽出

　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)の

　4種のプラスミドの抽出をした(カラムを使用したミニプレップ)

(2)　制限酵素処理

　(1)で抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した

　(1)で抽出したpSB6A1(K121013)を2つに分け、RFP,CFP,YFP用とpromoter用とした

　RFP,CFP.YFP用をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した

　promoter用をEcoRⅠとXbaⅠの2種の制限酵素で切断した

(3)　ゲル抽出

　(2)で制限酵素処理したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の

　インサートと pSB6A1(K121013)のベクターのゲル抽出を行った(青ゲル)

(4)　LigationとTrans formation

　(3)でゲル抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の

　インサートと pSB6A1(K121013)(RFP,CFP,YFP用)のLigationを行った

　前日にゲル抽出済みの AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターと

　(3)でゲル抽出したpSB6A1(K121013)(promoter用)のLigationを行った　

　LigationしたものをTFして、プレートを37℃・overnightでインキュベートした

Results

ゲル抽出の際にpSB1A2(I13507)のバンドが確認できなかったため抽出できなかった

それ以外に関してはTFまで完了した

以下の計5種

　　pSB6A1(E0430)

　　pSB6A1(E0420)

　　pSB6A1(K362007)

　　pSB6A1(K362011)

　　pSB6A1(K362013)

Consideration

試験管3本分ではゲル抽出でバンドがでない可能性が高い

確実にゲル抽出するためには5本以上の試験管での培養が必要と考えられる

September 7

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【時間】

9：00～

【実験担当】

岩城、竹内、中村、福山

【実験目的】

(1)　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP)),DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP)),

DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP)),DH5α(pSB6A1(SodA,GFP)),

DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))のコロニーをピックアップ

(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理

(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮

【実験内容】

(1)　コロニーをピックアップ

　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP))

　DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP))

　DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP))

　DH5α(pSB6A1(SodA,GFP))

　DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))

　それぞれのコロニーを32個ずつピックアップし、LBプレート(+amp)にストリークした

　↓37℃でインキュベートした

(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理

　PCR処理済みのAcrAB溶液400μlにMilliQ200μl加えた

　↓フェノールクロロホルム溶液を1.2mlほど加えてピペッティングし、vortexした

　↓室温、14,500rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収し、これに2-プロパノールを1.2mlほど加えた

　↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨て、70％エタノールを1.2mlほど加えた

　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した

　↓上清を捨てた

　↓遠心乾燥機で乾燥した

　↓MilliQを30μl加えた

　↓5μlとって2％アガロースゲル電気泳動で確認した(300bpあたりにバンドが見えた)

　↓100倍希釈で吸光度を計測した

　↓濃縮したプラスミド溶液24μlに下表2に従い各試薬を加えた

　↓調整した試料を37℃で一晩インキュベートした

＜表1＞吸光度計測結果
AD₂₆₀	0.071
	0.069
	0.069
	0.07
	0.071
平均	0.07

＜表2＞試薬組成
AcrAB	24μl
EcoRⅠ	0.84μl
PstⅠ	0.933μl
H Buffer	2.6μl
MilliQ	21.6μl
全量	約50μl

(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮

　DH5α(pSB6A1(promotor less,RFP))を1.5mlエッペンチューブにうつした

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓20℃、14,500rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を回収した

　↓溶出液量に対して酢酸ナトリウムを1/10倍、イソプロパノールを等量加えて混ぜた

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨て、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した

　↓上清を捨て、遠心乾燥機で乾燥した

　↓MilliQを30μl加えた

【結果】

(1)　翌日プレート上で各プラスミドを持つ大腸菌が培養出来ているのを確認した

(2)　制限酵素処理が上手くいったかどうかは確認できていない

翌日以降、電気泳動によって確認し、問題がなければゲル抽出する

(3)　どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である

翌日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う

September 8

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September 9

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September 10

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September 11

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 == September 5 ==
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+'''Time'''
+:9：30～
+'''Member'''
+:岩城、竹内、吉村
+:Iwaki,Takeuchi,Yoshimura
+'''Purpose'''
+:(1)　前日にシングルコロニーピックアップをしたpSB1C3(J04450)を
+::制限酵素処理を行うことにより、目的プラスミドの挿入を確認した
+:(2)　プロモーター挿入用のpSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507)
+::インサートを切り出してI13507の挿入用のpSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出
+:(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション
+'''Method'''
+:(1)　pSB1C3のプラスミド抽出と制限酵素処理による確認
+::　前日に2つのシングルコロニーをピックアップし2 mlのLB培地(+Cam)で37℃で一晩培養した
+::　↓1.5 mlをチューブに採った
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+::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
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+:(2)　RFPのバンドが見られなかった
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+'''Consideration'''
+:(1)　pSB1C3はベクター2072bp・インサート1069bpであり、
+::インサート部分の両端に今回使用した制限酵素で切断できる部位をもつので
+::電気泳動の結果と照らし合わせるとどちらのコロニーも目的プラスミドの挿入がなされていると考えられる
+::これを用いてマスタープレート・グリセロールストックの作成をする
+:(2)　制限酵素処理に失敗したと思われる
 == September 6 ==

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