Template:KIT-Kyoto-September3

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:Fukuyama,Adachi,Yoshimura
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:(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理　[吉村]
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:(3)　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),
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::pSB1A2(I13507),pSB6A1(BBa K121013)の電気泳動　[福山]
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:(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理
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::　前日から培養していた大腸菌を1.5mlエッペンにうつした
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::　↓15,000rpm,25℃で1分間遠心した（集菌）
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::　↓上清を捨てた
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::　↓SolutionⅠを250μl加え、ピペッティング、ボルテックスして沈殿を完全に溶かした
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::　↓溶出液を捨てた
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::　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した
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::　↓溶出液を捨て、もう一度13,000rpm,25℃で30秒間遠心した
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::　↓溶出液を捨て、チューブを蓋を切り取ったエッペンに取りかえた
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::　↓滅菌水を100μl加えた(DNA溶出)
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::　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心し、プラスミドを濃縮した
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::　　(値を右表1に示した)
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::　↓右表に示した組成で制限酵素処理を行った
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::　pSB6A1(BBa K121013)の制限酵素処理をするために吸光計によりOD<SUB>260</SUB>で濁度を測定した
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::　濁度の測定結果を右表3に示す
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::　　　表3: pSB6A1(BBa K121013)の100倍希釈したときの濁度
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::　表3より、DNA濃度：0.0108×100×50＝0.54×10<SUP>2</SUP>(μg/ml)と分かった
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::　これは制限酵素処理するのに濃度が低すぎるため、翌日濃縮することにした
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:(3)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(BBa K121013)の電気泳動
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::　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)を
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::　それぞれ5μlとって1μlのloading dyeを加えた
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::　↓1％アがロースゲルを用いて、1kbp ladderとともに100Vで3時間電気泳動した
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'''Results'''
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:(1)　バンドが出なかった
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:(2)　pSB6A1(BBa K121013)のDNA濃度が薄すぎたため、制限酵素処理ができなかった
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:(3)　pSB1A2(E0420)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　
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::pSB1A2(E0430)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　
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::pSB1A2(I13507)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　
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::pSB6A1(K121013)→バンドは確認できなかった
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'''Consideration'''
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:(1)　試薬に問題ありか？
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:(3)　pSB6A1(K121013)→非常に薄いDNA溶液であると思われる

Revision as of 06:06, 4 October 2010

September 3

>>top

Time

9:00～

Member

福山,足立,吉村
Fukuyama,Adachi,Yoshimura

Purpose

(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理　[吉村]
(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理　[足立]
(3)　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),
pSB1A2(I13507),pSB6A1(BBa K121013)の電気泳動　[福山]

Method

(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理
　前日から培養していた大腸菌を1.5mlエッペンにうつした
　↓15,000rpm,25℃で1分間遠心した（集菌）
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μl加え、ピペッティング、ボルテックスして沈殿を完全に溶かした
　↓SolutionⅡを250μl加え、4~5回上下にして混ぜた(膜溶解)
　↓1分間放置した
　↓SolutionⅢを350μl加えた(タンパク質析出)
　↓13,000rpm,25℃で5分間遠心した
　↓上清をカラムに流した
　↓13,000rpm,25℃で30秒間カラムごと遠心した
　↓溶出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μl加えた
　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した
　↓溶出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μl加えた
　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した
　↓溶出液を捨て、もう一度13,000rpm,25℃で30秒間遠心した
　↓溶出液を捨て、チューブを蓋を切り取ったエッペンに取りかえた
　↓滅菌水を100μl加えた(DNA溶出)
　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心し、プラスミドを濃縮した
　↓制限酵素処理を行うために吸光度を測った
　　(値を右表1に示した)
　↓右表に示した組成で制限酵素処理を行った
　↓37℃で40分間インキュベートした
　↓135Vで15分間電気泳動してカットチェックをおこなった
表1: 吸光度
×1/100 pSB6A1
1回目0.041
2回目0.047
3回目0.047
4回目0.050
5回目0.045
Ave.0.046
表2: 試薬組成
DNA10μl
EcoRⅠ0.3μl
PstⅠ0.3μl
M Buffer6μl
Milli Q7.4μl
Total20μl
(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理
　pSB6A1(BBa K121013)の制限酵素処理をするために吸光計によりOD260で濁度を測定した
　濁度の測定結果を右表3に示す
　　　表3: pSB6A1(BBa K121013)の100倍希釈したときの濁度
　表3より、DNA濃度：0.0108×100×50＝0.54×102(μg/ml)と分かった
　これは制限酵素処理するのに濃度が低すぎるため、翌日濃縮することにした
表3: 濁度
×1/100 pSB6A1
1回目0.007
2回目0.015
3回目0.008
4回目0.012
5回目0.012
Ave.0.0108
(3)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(BBa K121013)の電気泳動
　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)を
　それぞれ5μlとって1μlのloading dyeを加えた
　↓1％アがロースゲルを用いて、1kbp ladderとともに100Vで3時間電気泳動した

Results

(1)　バンドが出なかった
(2)　pSB6A1(BBa K121013)のDNA濃度が薄すぎたため、制限酵素処理ができなかった
(3)　pSB1A2(E0420)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　
pSB1A2(E0430)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　
pSB1A2(I13507)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　
pSB6A1(K121013)→バンドは確認できなかった


Consideration

(1)　試薬に問題ありか？
(3)　pSB6A1(K121013)→非常に薄いDNA溶液であると思われる
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