Template:KIT-Kyoto-Augsut28

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'''Results'''
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:(1)　今回作成したPMは今後使用していく予定
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:(2)　後日電気泳動により増幅の確認を行う
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:(3,4)　hemH、dpsに関してははっきりとバンドが見え、増幅が確認された
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::　＊詳細は写真参照
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:(3,4)SpeⅠが届き次第、制限酵素処理を行う
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:(5,6)pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のプレートからシングルコロニーをピックアップして、LB培地(1)で培養
:(5,6)pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のプレートからシングルコロニーをピックアップして、LB培地(1)で培養

Revision as of 11:21, 3 October 2010

August 28

>>top

Time

9:00～

Member

岩城,竹内,中村,臼井,革島
Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Usui,Kawashima

Purpose

(1)　AcrAB,dps,SodA,OxyRのプライマーミックス(PM)の作成　[竹内、臼井]
(2)　AcrAB,oxyRのPCR　[岩城]
(3)　dps,hemHのPCR　[臼井]
(4)　dps,hemHの電気泳動　[岩城]
(5)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ　[中村]
(6)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)の電気泳動　[中村]

Method

(1)　Primer MIXの作成
　AcrAB,dps,SodA,OxyRのPrimerF,PrimerRそれぞれ10μLずつを80μLのH2Oに溶解し、
　全量100μL、10pmol/μLにした溶液(PrimerMIX)を作成した
(2)　AcrAB,oxyRのPCR
＜PCR試薬組成＞
AcrABoxyR
PrimerF1.5μL1.5μL
dNTPs5μL5μL
KOD-Plus- Buffer5μL5μL
テンプレートDNA(DH5α)1μL1μL
MgSO44μL4μL
H2O33μL33μL
KOD-Plus-1μL1μL
total50μL50μL
＜設定＞
Pre Denature94℃2min
35Cycles↓
　Denature94℃15sec
　Annealing62.8℃30sec
　Extension68℃30sec
+Extension68℃2min
4℃∞


(3)　dps,hemHのPCR
＜PCR試薬組成＞
dpshemH
PrimerF1.5μL1.5μL
dNTPs5μL5μL
KOD-Plus- Buffer5μL5μL
テンプレートDNA(DH5α)0.5μL0.5μL
MgSO44μL4μL
H2O33μL33μL
KOD-Plus-1μL1μL
total50μL50μL
＜設定＞
Pre　Denature94℃2min
35Cycles↓
　Denature94.0℃15sec
　Annealing60.0℃30sec
　Extension68.0℃30sec
+Extension68.0℃2min
4℃∞


(4)　dps,hemHの電気泳動　
　(3)のPCRの後、増幅を確認するために電気泳動にかけ、写真撮影を行った
　諸条件を以下に示す
＜条件＞
　DNA量　　5μL
　電気泳動　100V　30min
　EtBr処理　20min
(5)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ
　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)について同様の操作を行った
　培養後の培養液1.5mLを1.5mLマイクロチューブに移した
　↓4℃、14,000rpm、5min遠心
　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)
　↓SolutionⅡ200μLを加え混合
　↓5min on ice
　↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
　↓5min on ice
　↓4℃、14,000rpm、10min遠心
　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
　↓4℃、14,000rpm、20min遠心
　↓70％EtOHを200μL加える
　↓4℃、14,000rpm、10min遠心
　↓30sec　遠心乾燥
　↓TE30μL加えてプラスミドDNAとした
(6)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)の電気泳動
　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のミニプレ後、電気泳動を行いチェックした
＜条件＞
　DNA量　5μL
　電気泳動　100V　20min
　EtBr処理　20min

Results

(1)　今回作成したPMは今後使用していく予定
(2)　後日電気泳動により増幅の確認を行う
(3,4)　hemH、dpsに関してははっきりとバンドが見え、増幅が確認された
(5,6)　pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)共に明瞭なバンドが確認された
　＊詳細は写真参照

Remarks

(3,4)SpeⅠが届き次第、制限酵素処理を行う
(5,6)pSB1A2(E0420)、pSB1A2(I13522)のプレートからシングルコロニーをピックアップして、LB培地(1)で培養
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