Template:KIT-Kyoto-week10

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:福山、竹内
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:(1)　pSB6A1(ahpC,GFP)の制限酵素処理、ゲルを使ったDNA抽出、ライゲーション、トランスフォーメーション　[福山]
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::　　　ベクター　：pSB1C3(EcoRⅠ,pstⅠでカット済み、CIAP処理済み)
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::　　　インサート：ahpC+GFP(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み)
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:(1)　表1のとおりに調製し、37℃で1時間インキュベートした
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::　↓2つあった表1の試料を合わせて、全量を200 μlにした
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::　↓MilliQを450 μl,酢酸ナトリウムを50 μl加え、
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::　　さらにフェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた
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::　↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
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::　↓上清を回収し、そこにイソプロパノールを800 μl加えた
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::　↓20分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
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::　↓上清を捨て、70%エタノールを500 μl加えた
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::　↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
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::　↓上清を捨て、乾燥させた
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::　↓沈殿をMilliQ 20 μlにとかし、Orange -loading dyeを5 μl加え、電気泳動を行った
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::　↓バンドを切り出して、MilliQを400 μl加えた
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::　↓フェノールを等量加え、ボルテックス
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::　↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
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::　↓上清を回収した
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::　↓フェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加え、ボルテックス
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::　↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
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::　↓上清を回収し、ベクターであるpSB1C3(''Eco''RⅠ,''pst''Ⅰでカット済み、CIAP処理済み)
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::　　の入ったエッペンドルフチューブに入れた(ベクターの正確な量はわからない)
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::　↓イソプロパノールをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた
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::　↓20分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
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::　↓上清を捨てた
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::　↓70%エタノールを500 μl加えた
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::　↓5分間遠心した(4℃、14,500 rpm)
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::　↓上清を捨てた
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::　↓乾燥させて、MilliQを10 μl加え、2xLigation Mixを10 μl加えた
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::　↓16℃に30分間置いた
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::　↓DH5α懸濁液を100 μl加えた
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::　↓氷上に30分間置いた
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::　↓42℃に30分間置いた
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::　↓氷上に2分間置いた
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::　↓soc培地を900 μl加えた
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::　↓37℃で1時間振とう培養した
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::　↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した
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::　↓37℃で一晩インキュベートした
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<TD COLSPAN="1">表1: 制限酵素処理</TD></TR>
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<TD>単位はμl</TD></TR>
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<TD>DNA溶液</TD><TD>88</TD></TR>
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'''Results'''
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::　特に結果として記すものはなかった
== October 12 ==
== October 12 ==

Revision as of 13:50, 24 October 2010

Contents

October 10

>>top

No experiments.

October 11

>>top

Time

9:00~

Member

福山、竹内
Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1)　pSB6A1(ahpC,GFP)の制限酵素処理、ゲルを使ったDNA抽出、ライゲーション、トランスフォーメーション　[福山]
　　　ベクター　：pSB1C3(EcoRⅠ,pstⅠでカット済み、CIAP処理済み)
　　　インサート：ahpC+GFP(EcoRⅠ,PstⅠでカット済み)

Method

(1)　表1のとおりに調製し、37℃で1時間インキュベートした
　↓2つあった表1の試料を合わせて、全量を200 μlにした
　↓MilliQを450 μl,酢酸ナトリウムを50 μl加え、
　　さらにフェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた
　↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
　↓上清を回収し、そこにイソプロパノールを800 μl加えた
　↓20分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
　↓上清を捨て、70%エタノールを500 μl加えた
　↓5分間遠心した(20℃、14,500 rpm)
　↓上清を捨て、乾燥させた
　↓沈殿をMilliQ 20 μlにとかし、Orange -loading dyeを5 μl加え、電気泳動を行った
　↓バンドを切り出して、MilliQを400 μl加えた
　↓フェノールを等量加え、ボルテックス
　↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
　↓上清を回収した
　↓フェノールクロロホルムをエッペンドルフチューブの8割ほど加え、ボルテックス
　↓5分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
　↓上清を回収し、ベクターであるpSB1C3(EcoRⅠ,pstⅠでカット済み、CIAP処理済み)
　　の入ったエッペンドルフチューブに入れた(ベクターの正確な量はわからない)
　↓イソプロパノールをエッペンドルフチューブの8割ほど加えた
　↓20分間遠心した(25℃、13,000 rpm)
　↓上清を捨てた
　↓70%エタノールを500 μl加えた
　↓5分間遠心した(4℃、14,500 rpm)
　↓上清を捨てた
　↓乾燥させて、MilliQを10 μl加え、2xLigation Mixを10 μl加えた
　↓16℃に30分間置いた
　↓DH5α懸濁液を100 μl加えた
　↓氷上に30分間置いた
　↓42℃に30分間置いた
　↓氷上に2分間置いた
　↓soc培地を900 μl加えた
　↓37℃で1時間振とう培養した
　↓クロラムフェニコール入りのLB寒天培地に植菌した
　↓37℃で一晩インキュベートした
表1: 制限酵素処理
単位はμl
DNA溶液88
EcoRⅠ1
PstⅠ1
Buffer H10
全量100

Results

　特に結果として記すものはなかった

October 12

>>top

October 13

>>top
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