Template:KIT-Kyoto-week9

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Revision as of 09:24, 24 October 2010

October 3

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Time

11:00~18:30

Member

岩城、福山、竹内、臼井、革島、吉村

Iwaki,Fukuyama,Takeuchi,Usui,Kawashima,Yoshimura

Purpose

(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション　[福山、革島]

(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)　[岩城]

(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養　[吉村]

(4)　ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR　[革島、吉村]

Method

(1)　昨日ゲル抽したpSB1C3,SufA,SufA+GFP,AhpC+GFP (E-Pcut)のライゲーション、トランスフォーメーション

＊ライゲーション

　pSB1C3 + SufA

　　　　+ SufA+GFP

　　　　+ AhpC+GFP　　　　をそれぞれTotal20μLで3セットずつ調整

　↓16℃30min

＊トランスフォーメーション

　コンピテントセル100μLずつ加えた

　↓氷上30min

　↓42℃45min

　↓氷上2min

　↓SOC培地900μL加えた

　↓1h振とう培養

　↓ストリーク

(2)　pSB1C3(ahpC:promoter only)のシークエンスを読む(10/1の続き)

　10/1にPCRをかけた続き(10/2の朝にPCRからだして冷凍保存しておいた)

　0.5 mlチューブに入っていたサンプルを1.5 ml チューブに移した

　↓3 M CH3COONaを1.5 μl加えた

　↓氷冷 15min.

　↓2-propanol 31.5 µl とMilli Q 7 µlを加えた

　↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)

　↓上清を捨てた

　↓70 % EtOHを50 µlを加えた

　↓cfg. (4 ℃,15000 rpm,20 min)

　↓Remove sup.

　↓遠心乾燥した(良く乾かすこと)

　↓Hi-Di formamide 15 µlに溶かした

　↓95 ℃,2 min加熱した

　↓氷冷(急冷)

　↓0.5 mlチューブのふたを切ってサンプルを移した

　↓シークエンス用のゴムのふたをした

　↓シークエンサーにいれた

(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3の培養

　ahpC(on GFP),sufA(on GFP),pSB1C3を試験管で振とう培養した

(4)　ahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,acrAB,dpsのPCR

　以下の組成とプログラムでPCRをahpC,sufA,oxyR,sodA,yaiA,SacrAB,dpsの各プロモーターについて2本ずつおこなった

＊ahpC,sufA,oxyR,sodA
プライマー(PM)	0.75ul
テンプレートDNA	0.5ul
MgSO₄	2ul
dNTPs	2.5ul
KODplus	0.5ul
Buffer	2.5ul
Milli Q	16.25ul
Total	25ul

表2: PCR設定
Pre Denature	Denature	Annealing	Extention	+Extention
94℃	94℃	61℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	1min	2min	∞
	35サイクル

＊PCR産物の確認

　各PCR反応後の溶液各5μLにLoading Buffer1μL加え6μLにした

　↓1%アガロースゲルに＊と１kbpマーカー3μLを添加した

　↓135v,20minで電気泳動

　↓20minEtBr染色

　↓UV照射下でバンドの確認

Results

(1)　翌日24時間後までSufA以外コロニーが見られなかった

(2)　明日、シークエンスを確認

(3)　ahpC(on GFP),sufA(on GFP)は培養に成功しているものもあったがpSB1C3に関しては翌日になるまで結果がわからない

(4)　吸光度を測定し濃度を計算した結果、

ahpC…1482ng/μl

　　2…360ng/μl

sufA1…265ng/μl

　　2…425ng/μl

oxyR1…367ng/μl

　　2…369ng/μl

sodA1…427ng/μl

　　2…340ng/μl

yaiA1…267ng/μl

　　2…481ng/μl

acrAB1…368ng/μl

　　2…557ng/μl

dps1…530ng/μl

　　2…440ng/μl

だった(全量は全て19μl)

＊電気泳動

　全てのバンドが正確な位置にはっきりと見られた

October 4

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October 5

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October 6

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Time

Member

福山、竹内

Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1)　DH5α( pSB1C3(sufA)), DH5α( pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ　[福山]

(2)　前日にアルカリミニプレップ処理した pSB1C3(sufA), pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]

Method

(1)　DH5α( pSB1C3(sufA)), DH5α( pSB1C3(ahpC))のシングルコロニーのピックアップ、アルカリミニプレップ

　前日の実験(1)のLBプレート培地に、コロニーが見られたので

　ピックアップして、それぞれをクロラムフェニコール入りのLB液体培地3 μlに植菌し、37℃で振5時間程振とう培養した

　↓遠心１分（25℃、14,500 rpm）して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた

　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分（25℃、14,500 rpm）

　↓上清を新しいチューブに移した

　↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）

　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた

　↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）

　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた

　↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）

　↓カラムを新しいエッペンに移し替えた

　↓カラムにMilliQを100 μl加えた

　↓遠心1分（4℃、15,000 rpm）

　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた

　↓遠心20分（4℃、15,000 rpm）(*1)

　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた

　↓遠心5分（4℃、15,000 rpm）

　↓上清を捨て、乾燥させた

　↓5 μlのMilli Qに溶かし4℃で保存した。そのうち1 μlはErBr入りのアガロースゲルを使って電気泳動した(*2)

(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス

　Premix 2 μl

　5xsequence buffer 1 μl

　Primer(1 μM) 1.6 μl

　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した

　総量 10 μl

表1: PCR設定
Pre Denature	Denature	Annealing	Extention	+Extention
96℃	96℃	50℃	60℃	4℃
1min	10sec	5sec	4min	∞
	30サイクル

エタノール沈殿

　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した

　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた

　↓氷上で15分間冷やした

　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた

　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた

　↓50 μlの70 % エタノールを加えた

　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた

　↓乾燥させた(よく乾かした)

　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした

　↓95 ℃で2分加熱した

　↓氷上で冷やした(急冷)

　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った

　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した

　↓シークエンス用の蓋をした

　↓シークエンサーに入れた

Results

(1)　(*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったので、

DNAの濃度を確かめる為に(*2)で電気泳動を行いバンドが見られるか確認した

その結果、バンドが観察されたので、明日以降PCRを行うのに有効なDNA試料であると思われる

(2)　十分に正確な塩基配列を読むことができなかった

Consideration

(1)　(*1)を終えた時点で沈殿が観察されなかったのは、培養時間が短く

(今回は5時間だったが、ベクターがpSB1C3の時は、今まではたいてい10時間以上培養していた)

DH5αが十分に増殖しておらず、プラスミドの濃度が低かったからだと思われる

(2)　コンタミの可能性が考えられる

October 7

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Time

18:00~

Member

福山、竹内

Fukuyama,Takeuchi

Purpose

(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ　[福山]

(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]

Method 【実験方法】

(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ

　前日の14時から今日の午前まで培養していたDH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))を

　遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた

　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)

　↓上清を新しいチューブに移した

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し替えた

　↓カラムにMilliQを100 μl加えた

　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)

　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた

　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)

　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた

　↓遠心5分(4℃、15,000 rpm)

　↓上清を捨て、乾燥させた

　↓それぞれの乾燥DNAを30 μlのMilliQに溶かした

　　このうち1 μlずつとってMilliQで100倍希釈した溶液の吸光度(260nm)を測定した

(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス

　H₂O 全量10 μlになるように調整した

　Premix 2 μl

　5xsequence buffer 1 μl

　Primer(1 μM) 1.6 μl

　プラスミド DNA DNA量が100-250 ngになるように調整した

　総量 10 μl

表1: PCR設定
Pre Denature	Denature	Annealing	Extention	+Extention
96℃	96℃	50℃	60℃	4℃
1min	10sec	5sec	4min	∞
	30サイクル

エタノール沈殿

　↓PCRの後、1.5 mlチューブに移した

　↓1.5 μlの3 M 酢酸ナトリウムを加えた

　↓氷上で15分間冷やした

　↓31.5 μlの2-プロパノールと7 μlのH2Oを加えた

　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた

　↓50 μlの70 % エタノールを加えた

　↓15,000 rpm、4 ℃で20分間遠心し、上清を捨てた

　↓乾燥させた(よく乾かした)

　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした

　↓95 ℃で2分加熱した

　↓氷上で冷やした(急冷)

　↓0.5 mlチューブの蓋を切り取った

　↓サンプルを1.5 mlチューブから0.5 mlチューブに移した

　↓シークエンス用の蓋をした

　↓シークエンサーに入れた

Results (1)100倍希釈したDNA溶液の吸光度の測定結果を表2に示す

表2: 吸光度測定結果
	ahpC-1	ahpC-2	sufA-1	sufA-2
	0.066	0.118	1.005	0.022
	0.053	0.114	0.681	0.023
	0.055	0.111	0.492	0.024
	0.048	0.106	0.448	0.016
	0.047	0.103	0.328	0.015
			0.276
平均	0.0538	0.1104	0.5383	0.02
希釈前の濃度 (ng/μl)	269	552	2692	100

(2)　後日、シークエンス結果を得たが、十分に塩基配列を読めていなかった

Consideration

(2)　RNA処理が十分に行われたいなかった可能性が高い

次回からはアルカリミニプレップなどでのRNA処理を十分にすべき

October 8

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October 9

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 == October 7 ==
 <div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
+'''Time'''
+:18:00~
+'''Member'''
+:福山、竹内
+:Fukuyama,Takeuchi
+'''Purpose'''
+:(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ　[福山]
+:(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス　[竹内]
+'''Method'''
+【実験方法】
+:(1)　DH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))のアルカリミニプレップ
+::　前日の14時から今日の午前まで培養していたDH5α(pSB1C3(sufA)),DH5α(pSB1C3(ahpC))を
+::　遠心1分(25℃、14,500 rpm)して集菌
+::　↓上清を捨てた
+::　↓SolutionⅠを250μlカラムに加えてピペッティングし、ボルテックスした
+::　↓SolutionⅡを250μlカラムに加えた
+::　↓SolutionⅢを350μlカラムに加え↓遠心5分(25℃、14,500 rpm)
+::　↓上清を新しいチューブに移した
+::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
+::　↓溶出液を捨て、SolutionⅣをカラムに500 μl加えた
+::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
+::　↓溶出液を捨て、SolutioⅤをカラムに700 μl加えた
+::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
+::　↓カラムを新しいエッペンドルフチューブに移し替えた
+::　↓カラムにMilliQを100 μl加えた
+::　↓遠心1分(4℃、15,000 rpm)
+::　↓溶出液に酢酸ナトリウム10 μl,イソプロパノール 100 μlを加えた
+::　↓遠心20分(4℃、15,000 rpm)(*1)
+::　↓上清を捨て、70%エタノールを800 μl加えた
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+::　　このうち1 μlずつとってMilliQで100倍希釈した溶液の吸光度(260nm)を測定した
+:(2)　前日にアルカリミニプレップ処理したpSB1C3(sufA),pSB1C3(ahpC)のシークエンス
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+::　↓15 μlのHi-Di formamideに溶かした
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+(1)100倍希釈したDNA溶液の吸光度の測定結果を表2に示す
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+:(2)　後日、シークエンス結果を得たが、十分に塩基配列を読めていなかった
+'''Consideration'''
+:(2)　RNA処理が十分に行われたいなかった可能性が高い
+::次回からはアルカリミニプレップなどでのRNA処理を十分にすべき
 == October 8 ==

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