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Template:KIT-Kyoto-week8
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:(4) 29日の実験ノートに結果を添付 | :(4) 29日の実験ノートに結果を添付 | ||
Revision as of 07:23, 23 October 2010
Contents |
September 26
Time
- 9：00～
Member
- 福山,臼井,革島,中村
- Fkuyama,Usui,Kawashima,Nakamura
Purpose
- (1) promoter less RFP、pSB1C3のミニプレ→制限酵素処理 [革島]
- (2) 各プロモーター入GFP on pSB6A1の制限酵素処理 [中村]
- (3) pSB1C3のゲル抽出 [福山]
- (4) ahpC,sufAの蛍光強度測定実験 [臼井]
Method
- (1) promoter less RFP、pSB1C3のミニプレ→制限酵素処理
- ＊ミニプレ
- 9/15カラム不使用のミニプレ参照
- 最後はRNase 20ng/μL入りMilliQ(50倍希釈) 30μLに溶かした
- ＊制限酵素処理
- pSB1C3：DNA濃度10万ng分をEcoRⅠ、pstⅠ1μL用い、Total 25μLで処理した(8本)
- promoter less RFP：DNA濃度10万ng分をEcoRⅠ、XbaⅠ1μL用い、Total 25μLで処理した(3本)
- (2) 各プロモーター入GFP on pSB6A1の制限酵素処理
- 各プロモーター(acrAB、ahpC、dps、oxyR、sodA、sufA、yaiA)
- の入ったpSB6A1をE-Pcutした(Overnight)
表1: 制限酵素処理試薬組成 acrAB ahpC dps oxyR sodA sufA yaiA </TR>DNAsol 8.8μL 5.5μL 8.56μL 7.1μL 6.96μL 8.7μL 6.2μL EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL 10xH 2.5μL Milli Q Final 25μLに調整
- (3) pSB1C3のゲル抽出
- 4種類の濃度（3589.8ng/μlが1試料,2393.2ng/μlが3試料,1196.6ng/μlが2試料,598.3ng/μlが1試料）
- pSB1C3計7試料(全量はそれぞれ50 μl)に3 μlずつCIAPを加えた
- ↓前日に作成した1％青ゲルを使って100Vで25分間電気泳動した
- 確認のため、同時に各試料5 μlずつとって1％アガロースゲルを使って135Vで15分間電気泳動した
- ↓確認のための電気泳動でバンドが確認できたので、バンドが見えなかった青ゲルをさらにEtBrで20分間染色した
- ↓UVを照射してバンドを確認できたので、ゲルを切り出した
- ↓各バンドの試料につき400 μlずつMilliQを加えた
- ↓フェノールを430 μlほど加えた
- ↓遠心（13,000 rpm、5分間、25℃）
- ↓上清を回収
- ↓フェノールクロロフォルムをエッペンチューブの8割ほど加え、vortex
- ↓遠心（13,000 rpm、5分間、25℃）
- ↓上清を回収
- ↓酢酸ナトリウムを50 μlずつ、イソプロパノールを800 μlずつ加えた
- ↓遠心（14,500 rpm,30分間,4℃）
- ↓上清を捨て、70％エタノールを500 μlずつ加えた
- ↓遠心（14,500 rpm,30分間,4℃）
- ↓上清を捨て、乾燥させた
- ↓TEを11 μlずつ加えた
- ↓冷凍庫で保存
- (4) ahpC,sufAの蛍光強度測定実験
- 菌液濁度(O.D.600)を0.4~0.6に調整した
- ↓終濃度がlessおよび1nM～1mM(10倍刻み)になるように、菌液に過酸化水素を付加した
- ↓37℃でインキュベートし、10分ごとに菌液500μLずつ回収した
- ↓cfg.4℃ 14,000rpm,1min
- ↓上清を除いた
- ↓1xPBS 100μLでペレットを溶解した
- ↓全量を蛍光強度測定に用いた
- ※この操作を80分まで行った
Results
- (1)
表2: 濁度測定 RFP 1 RFP 2 RFP 3 RFP 4 RFP 5 RFP 6 RFP 7 pSB1C3 OD260 0.753 0.589 0.756 0.505 0.503 0.517 0.456 0.570 DNA濃度 18825 14725 18825 12625 12591 12925 11400 14250 全量 28 29 29 29 29 29 29 29
- (2)明日、ゲル抽予定
- (3)吸光度をまだ測っていないので、ゲル抽出が上手くいったのかはわからない
Consideration
- (1) 問題なく実験はうまくいった
- (3) 今までも、青ゲルを使った抽出のための電気泳動で、バンドが見えないことがあったようだが、
- 今回のように EtBr染色し、UVにあてるとバンドの存在が確認できるケースも結構あったのかもしれない。
- (4) 29日の実験ノートに結果を添付
