Template:KIT-Kyoto-week5

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(Difference between revisions)

Revision as of 08:11, 4 October 2010

September 5

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Time

9：30～

Member

岩城、竹内、吉村

Iwaki,Takeuchi,Yoshimura

Purpose

(1)　前日にシングルコロニーピックアップをしたpSB1C3(J04450)を

制限酵素処理を行うことにより、目的プラスミドの挿入を確認した

(2)　プロモーター挿入用のpSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507)

インサートを切り出してI13507の挿入用のpSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出

(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション

Method

(1)　pSB1C3のプラスミド抽出と制限酵素処理による確認

　前日に2つのシングルコロニーをピックアップし2 mlのLB培地(+Cam)で37℃で一晩培養した

　↓1.5 mlをチューブに採った

　↓25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓カラムを新しいチューブに乗せ換えた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　それぞれ10 µlを別のチューブに採った

　↓H bufferを5 µl加えた

　↓蒸留水を34 µl加えた

　↓EcoRⅠとPstⅠを0.5 µlずつ加えた

　↓37℃で1.5時間インキュベートした

　↓1 %ゲルを用いて、100 Vで25分間電気泳動した

　↓20分間EtBrで染色した

　↓紫外線を照射し写真を撮影した

(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出

　PCR用のpSB6A1,RFP,pSB6A1を右表1,2の組成で平常通り制限酵素処理した

　↓右表3,4の組成でゲルにアプライした

　↓50Vで30分間電気泳動した

　↓UVを照射してゲルを切り出した

　↓H2O　400μLを加えた

　↓65℃　40minでヒートブロック

　↓Phe等量加えて　vortex

　↓cfg.　14500rpm　5min　25℃

　↓上清を新チューブへ

　↓Phe/Chl等量　voltex　　

　↓cfg. 14500rpm　5min　25℃

　↓上清を新チューブへ

　↓3M CH₃COONa　50μLを加えた

　↓イソプロ　800μLを加えた

　↓cfg.　14500rpm　10min　4℃

　↓上清除き、70％EtOH 150μL

　↓cfg.　14500rpm 5min 4℃

　↓遠心乾燥機　5min

　↓MilliQ　10μLを加えた

表1: PCR用pSB6A1
DNAsol	262μL
EcoRⅠ	4μL
XbaⅠ	4μL
Buffer M	30μL
total	300μL

表2: RFP,pSB6A1
DNAsol	85μL
EcoRⅠ	2.5μL
PstⅠ	2.5μL
Buffer H	10μL
total	100μL

表3: PCR用のpSB6A1
DNA	300μl
Orange Loading Dye	50μl

表4: RFP,pSB6A1
DNA	100μl
Orange Loading Dye	20μl

(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション

　コンピテントセルにDNAを入れた

　↓20分間氷冷した

　↓43℃のウォーターバスに45秒間いれた

　↓5分間氷冷した

　↓SOC培地を900μl加えた

　↓20分間,37℃のインキュベーターに入れた

　↓13000rpm,4℃,1分間遠心した

　↓培養液を少し捨て量を減らし、ピペッティングした

　LBプレートにまき、37℃のインキュベーターに入れてovernight

Results

(1)　以下のようにサンプルを泳動した

レーン1	1Kb Maker
レーン2	コロニー1から抽出したプラスミド
レーン3	コロニー1から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの
レーン4	コロニー2から抽出したプラスミド
レーン5	コロニー2から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの

レーン2と4で同じ長さのバンドが確認できた

またレーン3と5では2本のバンドが確認でき、3と5で長さに違いはなかった

(2)　RFPのバンドが見られなかった

(3)　全てのプレートでコロニーの生育が見られた

Consideration

(1)　pSB1C3はベクター2072bp・インサート1069bpであり、

インサート部分の両端に今回使用した制限酵素で切断できる部位をもつので

電気泳動の結果と照らし合わせるとどちらのコロニーも目的プラスミドの挿入がなされていると考えられる

これを用いてマスタープレート・グリセロールストックの作成をする

(2)　制限酵素処理に失敗したと思われる

September 6

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Time

8:30～20:30

Member

岩城

Iwaki

Purpose

(1)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のプラスミドを抽出する

(2)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)を制限酵素処理する

(3)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のゲル抽出

(4)　RFP・CFP・YFPをpSB1A2からpSB6A1に乗せ換える

AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターをpSB6A1(K121013)のRBSの前に挿入する

Method

(1)　プラスミド抽出

　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)の

　4種のプラスミドの抽出をした(カラムを使用したミニプレップ)

(2)　制限酵素処理

　(1)で抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した

　(1)で抽出したpSB6A1(K121013)を2つに分け、RFP,CFP,YFP用とpromoter用とした

　RFP,CFP.YFP用をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した

　promoter用をEcoRⅠとXbaⅠの2種の制限酵素で切断した

(3)　ゲル抽出

　(2)で制限酵素処理したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の

　インサートと pSB6A1(K121013)のベクターのゲル抽出を行った(青ゲル)

(4)　LigationとTrans formation

　(3)でゲル抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の

　インサートと pSB6A1(K121013)(RFP,CFP,YFP用)のLigationを行った

　前日にゲル抽出済みの AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターと

　(3)でゲル抽出したpSB6A1(K121013)(promoter用)のLigationを行った　

　LigationしたものをTFして、プレートを37℃・overnightでインキュベートした

Results

ゲル抽出の際にpSB1A2(I13507)のバンドが確認できなかったため抽出できなかった

それ以外に関してはTFまで完了した

以下の計5種

　　pSB6A1(E0430)

　　pSB6A1(E0420)

　　pSB6A1(K362007)

　　pSB6A1(K362011)

　　pSB6A1(K362013)

Consideration

試験管3本分ではゲル抽出でバンドがでない可能性が高い

確実にゲル抽出するためには5本以上の試験管での培養が必要と考えられる

September 7

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Time

9：00～

Member

岩城、福山、竹内、中村

Iwaki,fukuyama,Takeuchi,Nakamura

Purpose

(1)　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP)),DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP)),

DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP)),DH5α(pSB6A1(SodA,GFP)),

DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))のコロニーをピックアップ [福山]

(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理　[福山]

(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮　[福山]

(4)　AcrABのPCR　[中村]

(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ

(6)　lacZのアルカリミニプレップ

Method

(1)　コロニーをピックアップ

　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP))

　DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP))

　DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP))

　DH5α(pSB6A1(SodA,GFP))

　DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))

　それぞれのコロニーを32個ずつピックアップし、LBプレート(+amp)にストリークした

　↓37℃でインキュベートした

(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理

　PCR処理済みのAcrAB溶液400μlにMilliQ200μl加えた

　↓フェノールクロロホルム溶液を1.2mlほど加えてピペッティングし、vortexした

　↓室温、14,500rpmで5分間遠心した

　↓上清を回収し、これに2-プロパノールを1.2mlほど加えた

　↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨て、70％エタノールを1.2mlほど加えた

　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した

　↓上清を捨てた

　↓遠心乾燥機で乾燥した

　↓MilliQを30μl加えた

　↓5μlとって2％アガロースゲル電気泳動で確認した(300bpあたりにバンドが見えた)

　↓100倍希釈で吸光度を計測した

　↓濃縮したプラスミド溶液24μlに下表2に従い各試薬を加えた

　↓調整した試料を37℃で一晩インキュベートした

表1: 吸光度計測結果
AD₂₆₀	0.071
	0.069
	0.069
	0.07
	0.071
平均	0.07

表2: 試薬組成
AcrAB	24μl
EcoRⅠ	0.84μl
PstⅠ	0.933μl
H Buffer	2.6μl
MilliQ	21.6μl
全量	約50μl

(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮

　DH5α(pSB6A1(promotor less,RFP))を1.5mlエッペンチューブにうつした

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓20℃、14,500rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した

　↓溶出液を回収した

　↓溶出液量に対して酢酸ナトリウムを1/10倍、イソプロパノールを等量加えて混ぜた

　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した

　↓上清を捨て、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した

　↓上清を捨て、遠心乾燥機で乾燥した

　↓MilliQを30μl加えた

(4)　AcrABのPCR

　下表1,2に示した試薬組成、設定に従ってPCRを行った

組成
AcrABM	1.5μL
Buffer	5μL
dNTPs	5μL
KOD-Plus	1μL
MgSO₄	4μL
鋳型DNA	0.5μL
H₂O	33μL
Total	50μL

PCR設定
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	60.2℃	68℃	68℃	4℃
5min	15sec	30sec	20sec	2min	∞
	30サイクル

(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ

　pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ

　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した

　↓上清をカラムに入れた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた

　↓電気泳動した

(6)　lacZのアルカリミニプレップ

　集菌後、水分を十分に取り除き、SolutionⅠ250μLを加えた

　↓vortexにより混合した後、SolutionⅡ250μLを加え、上下に2，3度転倒させて混ぜた

　↓SolutionⅢ350μLを加え、よく混合した

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min

　↓上清をカラムに移した

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　30sec　カラム下部の液を捨てた

　↓SolutionⅣ500μLを加えた

　↓cfg.　20℃　13,000rpm　1min　カラム下部の液を捨てた

　↓SolutionⅤ700μLを加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　1min×２

　↓酢酸ナトリウム50μL、イソプロパノール800μLを加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　10min

　↓上清を除いた

　↓70%EtOHをエッペンの8分目まで加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min

　↓遠心乾燥　2min

　↓滅菌水100μLに溶かした

Results

(1)　翌日プレート上で各プラスミドを持つ大腸菌が培養出来ているのを確認した

(2)　制限酵素処理が上手くいったかどうかは確認できていない

翌日以降、電気泳動によって確認し、問題がなければゲル抽出する

(3)　どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である

翌日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う

(4)　ゲル抽出をするのに十分な濃度の試料を得ることができた。

(5)　バンドは検出できなかった、iGEMの製作した試薬には問題ありと考えられる

(6)　lacZの吸光度は0,1468（×1/100）でDNA濃度は734g/μLであった

　　　→冷蔵保存

September 8

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Time

9：00～

Member

岩城、福山、古道、竹内、中村

Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Purpose

(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮

(2)　pSB6A1（E0420）の培養

(3)　SodA,OxyR,yaiAのPCR

(4)　PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理

(5)　pSB1C3のイソプロ沈

Method

(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮

　4時間ほどLB液体培地で培養した各E.Coliをそれぞれ1.5mlエッペンに8割ほど移した

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して

　　それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。

　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

　↓MilliQを各種プラスミドにつき30μlずつ加えた

(2)　pSB6A1（E0420）の培養

　前日にAmp入りLB寒天培地にストリークしたpSB6A1(E0420)を

　2mlのLB液体培地が入った試験管6本に一部うつして　　　　　

　振とう培養した

(3)　SodA,OxyR,yaiAのPCR

　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を

　すでにMixしたプライマー(SodA, OxyR,yaiA)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた

　↓それぞれのエッペンに下表1の組成で溶液を加えた

　↓下表2,3のプログラムでPCR反応を行った

　↓PCR産物を電気泳動にかけた

表1: 試薬組成
テンプレートDNA(DH5α)	各0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-	5μL
2mM d NTPs	5μL
2mM MgSO₄	4μL
MilliQ	33μL
KOD-Plus-	1μL
total	50μL

表2: SodA,OxyRのPCR反応
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	62.7℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	1min	2min	保持
	30サイクル

表3: yaiAのPCR反応
熱変性	熱変性	アニーリング	伸長反応	伸長反応	保存
94℃	94℃	60.4℃	68℃	68℃	4℃
2min	15sec	30sec	38sec	2min	保持
	30サイクル

(4)　PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理

　PCR済のSodA, OxyR,yaiAにそれぞれ200µlずつ滅菌水を加えた

　↓フェノールクロロホルム(φ OH/CIAA)200µl加えた

　↓4℃、14,000rpmで10min遠心した

　↓上清を回収しそれにクロロホルムイソアミルアルコール(CIAA)を200µl加えボルテックスした

　↓4℃、14,000rpmで10min遠心した

　↓上清を回収しそれに3M CH₃COONaを50µl加え混ぜた

　↓イソプロパノール0.5ml加えて混ぜ4℃、14,000rpmで20min遠心した

　↓上澄みを捨て70％エタノール200µl加え4℃、14,000rpmで10min遠心した

　↓上澄みを捨てて乾燥させた

　↓滅菌水を30µl加えた

　↓冷蔵保存した

(5)　pSB1C3のイソプロ沈

　TEに溶かした状態のpSB1C3ベクター50μLに、CH₃COONa50μL、イソプロパノール800μLを加えた

　↓cfg.　25℃　13,000rpm　15min

　↓上清を捨てた

　↓70%EtOH800μLを加えた

　↓cfg.　25℃　14,500rpm　5min

　↓EtOHを除いた

　↓遠心乾燥　2min

　↓滅菌水30μLに溶かした

Results

(1)　まだどれほどの量でプラスミドが回収できたのかは分からない

(2) 培養に成功していれば明日にもアルカリミニプレップを行う予定

(3)　PCR産物を電気泳動にかけた結果、すべて、バンドが検出されたので、今後使用するものとする

(4)　実験(3)で得られたPCR産物のクロロホルム処理を行い冷蔵保存した

これを次回の実験に用いる(制限酵素処理など)

(5)冷蔵保存

September 9

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Time

9：00～

Member

竹内、中村、吉村

Takeuchi,nakamura,Yoshimura

Purpose

(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出　[吉村]

(2)　(1)と前日(9/8)にプラスミド抽出した

pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出　[吉村]

(3)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定　[中村]

Method

(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出

　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)を1.5mlエッペンチューブにうつした

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌

　↓上清を捨てた

　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした

　↓SolutionⅡを250μl加えた

　↓SolutionⅢを350μl加えた

　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)

　↓上清をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた

　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓抽出液を捨てた

　↓滅菌水をカラムに入れた

　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)

　↓溶出液を回収

　↓CH₃COONaとイソプロパノールを

　　溶出液量に対してそれぞれ1/10倍、等量加えてまぜた

　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた

　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)

　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥

　↓MilliQを30μl加えた

(2)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出

　今回は青ゲルを使わずにUV照射でバンドの位置を確認してゲル抽出を行う方法をとった

　DNAを下表1,2,3のように制限酵素処理した

　↓3時間,37℃でインキュベート

　↓アガロースゲルに下表4の全量をapplyした

　↓50V,50minで電気泳動した。

　↓20min EtBrに浸した

　↓暗室でUVをゲルに照射し、バンドの位置を確認してゲルを切り出した

表1: CFP
DNA	40μl
EcoRⅠ	1.5μl
XbaⅠ	1.5μl
M Buffer	5μl
milliQ	2μl
total	50μl

表2: RFP,YFP
DNA	30μl
EcoRⅠ	1.5μl
XbaⅠ	1.5μl
M Buffer	5μl
milliQ	12μl
total	50μl

表3: TetR
DNA	30μl
EcoRⅠ	1.5μl
PstⅠ	1.5μl
H Buffer	5μl
milliQ	12μl
total	50μl

表4: 試薬組成
Marker(1kb)	3μl
Loadiing Buffer	10μl
DNA	全量

(3)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定

冷蔵保存されていたoxyR、sodA、yaiA on pSB6A1をそれぞれ、100倍希釈で吸光度測定した

Results

(2,3)　CFP,YFP,TetRはバンドが見え、切り出しに成功した

　⇒冷蔵庫に保存、翌日のLigationに使用する

　RFPはバンドが見えなかった

　⇒ミニプレの必要あり

(4)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定結果(100倍希釈)

	吸光度	DNA濃度
oxyR	0.018(5回平均)	90ng/μL
sodA	0.058(5回平均)	290ng/μL
yaiA	0.029(5回平均)	145ng/μL

September 10

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 == September 9 ==
 <div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
+'''Time'''
+:9：00～
+'''Member'''
+:竹内、中村、吉村
+:Takeuchi,nakamura,Yoshimura
+'''Purpose'''
+:(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出　[吉村]
+:(2)　(1)と前日(9/8)にプラスミド抽出した
+::pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出　[吉村]
+::(3)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定　[中村]
+'''Method'''
+:(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出
+::　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)を1.5mlエッペンチューブにうつした
+::　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
+::　↓上清を捨てた
+::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
+::　↓SolutionⅡを250μl加えた
+::　↓SolutionⅢを350μl加えた
+::　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
+::　↓上清をカラムに入れた
+::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
+::　↓抽出液を捨てた
+::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
+::　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
+::　↓抽出液を捨てた
+::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
+::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
+::　↓抽出液を捨てた
+::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
+::　↓抽出液を捨てた
+::　↓滅菌水をカラムに入れた
+::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
+::　↓溶出液を回収
+::　↓CH<SUB>3</SUB>COONaとイソプロパノールを
+::　　溶出液量に対してそれぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
+::　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)
+::　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
+::　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)
+::　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
+::　↓MilliQを30μl加えた
+:(2)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出
+::　今回は青ゲルを使わずにUV照射でバンドの位置を確認してゲル抽出を行う方法をとった
+::　DNAを下表1,2,3のように制限酵素処理した
+::　↓3時間,37℃でインキュベート
+::　↓アガロースゲルに下表4の全量をapplyした
+::　↓50V,50minで電気泳動した。
+::　↓20min EtBrに浸した
+::　↓暗室でUVをゲルに照射し、バンドの位置を確認してゲルを切り出した
+::<TABLE BORDER="0"><TR>
+::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
+::<TD>表1: CFP</TD>
+::<TR>
+::<TD>DNA</TD><TD>40μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>''Xba''Ⅰ</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>M Buffer</TD><TD>5μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>milliQ</TD><TD>2μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>total</TD><TD>50μl</TR>
+::</TABLE></TD>
+::<TD></TD><TD></TD>
+::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
+::<TD>表2: RFP,YFP</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>DNA</TD><TD>30μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>''Xba''Ⅰ</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>M Buffer</TD><TD>5μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>milliQ</TD><TD>12μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>total</TD><TD>50μl</TD></TR>
+::</TABLE></TD>
+::<TD></TD><TD></TD>
+::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
+::<TD>表3: TetR</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>DNA</TD><TD>30μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>''Pst''Ⅰ</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>H Buffer</TD><TD>5μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>milliQ</TD><TD>12μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>total</TD><TD>50μl</TD></TR>
+::</TABLE></TD>
+::<TD></TD><TD></TD>
+::<TD VALIGN="bottom"><TABLE BORDER="1"><TR>
+::<TD>表4: 試薬組成</TD>
+::<TR>
+::<TD>Marker(1kb)</TD><TD>3μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>Loadiing Buffer</TD><TD>10μl</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>DNA</TD><TD>全量</TD></TR>
+::</TABLE>
+::</TD></TR></TABLE>
+::(3)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定
+::冷蔵保存されていたoxyR、sodA、yaiA on pSB6A1をそれぞれ、100倍希釈で吸光度測定した
+'''Results'''
+:(2,3)　CFP,YFP,TetRはバンドが見え、切り出しに成功した
+::　⇒冷蔵庫に保存、翌日のLigationに使用する
+::　RFPはバンドが見えなかった
+::　⇒ミニプレの必要あり
+:(4)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定結果(100倍希釈)
+::<TABLE BORDER="1"><TR>
+::<TD></TD><TD>吸光度</TD><TD>DNA濃度</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>oxyR</TD><TD>0.018(5回平均)</TD><TD>90ng/μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>sodA</TD><TD>0.058(5回平均)</TD><TD>290ng/μL</TD></TR>
+::<TR>
+::<TD>yaiA</TD><TD>0.029(5回平均)</TD><TD>145ng/μL</TD></TR>
+::</TABLE>
 == September 10 ==

Template:KIT-Kyoto-week5

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Revision as of 08:11, 4 October 2010

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