Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September24

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== plasmidとGFP+double terminatorのdigestion ==
== plasmidとGFP+double terminatorのdigestion ==
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#以下の組成で試薬を調整した。
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以下の組成で試薬を調整した。
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!Reagent
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{|style="text-align: center" class="protocol"
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!Reagent
!Reagent
!Amount
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#37C,1hour置いた。
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#Mycrocon YM-10を使って切れ端の除去を行う。sampleが500 uLになるようにTEを加え、カラムに移した。
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#上澄みが30 uL前後残ったので、それを新しいcollection tubeに移し、カラムを逆さまにして挿入した。
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#4C,1000g,3min遠心した。
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#GFP+double terminatorが30 uL、plasmid25 uL回収できたので、各1/10量の3M CH3COONaを加えた。
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#100%EtOHを回収量の2.5倍量加え、voltexにかけた。
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#4C,15000rpm,10min遠心した。
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#上澄みを捨て、70%EtOHを500 uL加え、voltexにかけた。
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#4C,15000rpm,5min遠心した。
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#上澄みを捨て、真空装置へ入れよく乾燥させた。
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#2 uLのTEで溶かした。
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#-20Cで凍結保存した。
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== Transformation of BAC Vector ==
== Transformation of BAC Vector ==

Revision as of 03:39, 26 September 2010

Notebook
  • Arac+RBS+pSB1A3保有株のminiprep
  • miniprep後のサンプル泳動

Arac+RBS+pSB1A3保有株のminiprep

  1. 昨日懸濁しておいた菌を1 mLずつ1.5 mLチューブ2本に分注した。
  2. 4C,15000rpm,1minで遠心した。
  3. 上澄みを捨て、4Cで保存しておいたBuffer P1をそれぞれ125 uLずつ入れ、Voltexで撹拌した。
  4. Buffer N3を175 uLずつ入れ、すぐに転倒混和した。
  5. 4C,13000rpm,10min遠心した。
  6. 上澄みをデカントでカラムに移し、4C,13000rpm,1minで遠心した。
  7. 下澄み液を捨て、500 uLのBuffer PBを添加して、4C,13000rpm,1minで遠心した。
  8. 下澄みを捨て、さらに1min遠心した。
  9. 新しい1.5 mLチューブにカラムを移し、TEを50 uL入れ1min放置した後、1min遠心した。


miniprep後のサンプル泳動

１　uLのサンプルとloading　buffer1 uL混ぜ、6 uLのλ/Hind Ⅲ　EcoRⅠとともに泳動した。


HokkaidoU Japan 20100924a.JPG


マーカーとの比較からこのプラスミドは7000bp位の大きさだと思われる。

Arabinose Promoter+RBS+pSB1A3のbp数が3455bpなので、パーツ及びベクターを2個ずつ含むプラスミドであると考えられる。

この写真から、プラスミド溶液の濃度は30　ng/uL と推定した。






plasmidとGFP+double terminatorのdigestion

以下の組成で試薬を調整した。

Reagent Amount
DW 5.6 uL
10x H　Buffer 1 uL
0.1% BSA 1 uL
Spe I 0.2 uL
Pst I 0.2 uL
plasmid 2 uL
Total 10 uL
Reagent Amount
DW 34 uL
10x M　Buffer 5 uL
0.1% BSA 5 uL
Xba I 4 uL
Pst I 0.4 uL
GFP+double terminator 1.6 uL
Total 50 uL













  1. 37C,1hour置いた。
  2. Mycrocon YM-10を使って切れ端の除去を行う。sampleが500 uLになるようにTEを加え、カラムに移した。
  3. 4C,14000g,1hour遠心した。
  4. 上澄みが30 uL前後残ったので、それを新しいcollection tubeに移し、カラムを逆さまにして挿入した。
  5. 4C,1000g,3min遠心した。
  6. GFP+double terminatorが30 uL、plasmid25 uL回収できたので、各1/10量の3M CH3COONaを加えた。
  7. 100%EtOHを回収量の2.5倍量加え、voltexにかけた。
  8. 4C,15000rpm,10min遠心した。
  9. 上澄みを捨て、70%EtOHを500 uL加え、voltexにかけた。
  10. 4C,15000rpm,5min遠心した。
  11. 上澄みを捨て、真空装置へ入れよく乾燥させた。
  12. 2 uLのTEで溶かした。
  13. -20Cで凍結保存した。


Transformation of BAC Vector

  • Used DH5Alpha and MG1655 strains for electroporation
  • Plated at 19:15
  • Will be incubated for 18 h
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