Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August18

From 2010.igem.org

(Difference between revisions)
(→RBS digestionのリベンジ)
(→Ligation & Transformation)
Line 77: Line 77:
===Ligation & Transformation===
===Ligation & Transformation===
{|style="text-align:center;" class="protocol"
{|style="text-align:center;" class="protocol"
 +
!Reagent
 +
!Amount
|-
|-
|DNA solution
|DNA solution
Line 86: Line 88:
|T4 ligase
|T4 ligase
|1 uL
|1 uL
 +
|-
 +
|style="border-top:1px solid #000;"|'''Total'''
 +
|style="border-top:1px solid #000;"|'''13.6 uL'''
|}
|}
Line 97: Line 102:
* spread onto the LBC
* spread onto the LBC
* 37℃，15~20 hrs
* 37℃，15~20 hrs
-
 
=RBS 再リベンジ=
=RBS 再リベンジ=

Revision as of 06:30, 20 September 2010

Notebook

RBS digestionのリベンジ

HokkaidoU Japan 20100818a.JPG
Reagent Amount
1-2M 10 uL
DW 4 uL
10x M Buffer 2 uL
BSA 2 uL
Xba I 1 uL
Pst I 1 uL
Total 20 uL

→37℃で60分インキュベーション

  • 4 uL 6x Sample Bufferを加え，12 uLずつ電気泳動した

→ゲル抽出
→10 uLを電気泳動で確認（TSUDA Marker 1）

だめぽでした！

  • おそらくゲル抽出後の吸着でうまくいかず，流れてしまった（小さすぎた）

Ligation

Ligationに必要なDNA Solutionの調製

パーツ λ/Hind IIIと比べて (ng/10 uL) ng/uL 割合 size (bp) 必要 (ng) 使用 (uL)
Vector 50 ng/10 uL 5 ng/uL 1 2000 bp 10 ng 2 uL
RFP 250 ng/10 uL 25 ng/uL 2 700 bp 7 ng 0.3 uL
double terminator 5 ng/10 uL 0.5 ng/uL 2 200 bp 2 ng 4 uL
Total 6.3 uL

Ligation & Transformation

Reagent Amount
DNA solution 6.3 uL
Ligation solution 6.3 uL
T4 ligase 1 uL
Total 13.6 uL
  • 16℃，30 min
  • competent cell 50 uLに全量加えた（Transformation）
  • 0℃，30 min
  • 42℃，60 sec
  • 5 min on ice
  • add LB 100 uL
  • 37℃，120 min
  • spread onto the LBC
  • 37℃，15~20 hrs

RBS 再リベンジ

Digestion後，エタ沈で回収を試みた

（RBS）1-2M 10 uL
DW 4 uL
10x M Buffer 2 uL
BSA 2 uL
Xba I 1 uL
Pst I 1 uL
Total 20 uL

→37℃，60 min

エタ沈

  • 2 uLの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
  • 44 uLのエタノールを加えた
  • 液体窒素の中で凍らせた（1.5 mLのチューブに移す）
  • 溶かしてから15,000 rpm @4℃で５分間遠心した
  • 上清をほかのチューブに移した（一応これも遠心し，上清を捨て，同じ操作をした）
  • 100 uLの70%エタノールで壁をリンスし，15,000 rpm @4℃で５分間遠心した
  • 上清を捨て，真空デシケータで乾燥させた
  • TE 5 uLで溶かした

電気泳動

HokkaidoU Japan 20100818b.JPG
  • TEで溶かしたDNA Solution 1 uLに6x SB 1 uLを加えた
  • 最初にとった上清も同じ操作をした
レーン
2 TSUDA Marker 1
3 上清
4 DNA solution
  • DNA solutionにしっかり回収されていた
Retrieved from "http://2010.igem.org/Team:HokkaidoU_Japan/Notebook/August18"