Template:KIT-Kyoto-Augsut13

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Revision as of 03:28, 26 September 2010

August 13

【時間】

9:00～21:00

【実験担当】

岩城,竹内,中村,吉村,足立

【実験目的】

(1)　12日にLB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする

(2)　前日に培養したpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のプラスミド抽出

(3)　DH5αに目的プラスミドpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)が挿入されているか制限酵素処理をすることによって確かめる

【実験内容】

(1)　pSB3K3(J04450)のトランスフォーメーション

　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した

　↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した

　↓on　ice　30min

　↓45℃で45sec、過熱した

　↓on　ice　2min

　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた

　↓37℃で1h、振とう培養した

　↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight

(2)　pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のミニプレップ

　培養後のpSB1A2(J44000)とpSB6A1(J04450)を1.5mLチューブに取った

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)

　↓5min on ice

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)

　↓5min on ice

　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した

　↓上澄みを捨てた

　↓30秒間遠心乾燥を行った

　↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした

(3)　pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)の制限酵素処理と電気泳動

	pSB1A2(J44000)	pSB6A1(J04450)
XbaⅠ,PstⅠ	1μL	-
EcoRⅠ,SpeⅠ	-	1μL
(2)で得たpSB1A2 プラスミド	5μL	-
(2)で得たpSB6A1 プラスミド	-	5μL
H₂O	11μL	11μL
H Buffer	1μL	2μL
M Buffer	1μL	-
計	20μL	20μL

右の組成で1.5mlチューブ内で混合した

37℃で1時間インキュベートした

↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した

　(マーカーは1kbp radderを使用した)

↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した

↓泳動結果を写真で撮影した

【実験結果】

(1)　　2つのコロニーの生育を確認した(ピンク)

(2,3)　pSB6A1(J04450)→2本のバンドが確認できたことにより、目的プラスミドの挿入が確認できた

　pSB1A2(J44000)→バンドが検出できなかった

【実験考察】

(1)

(2,3)　翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る

　翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う

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 【実験担当】
 :岩城,竹内,中村,吉村,足立
-【実験名】
-:(1)　pSB3K3のトランスフォーメーション
-:(2)　pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
-:(3)　pSB1A2,pSB6A1の電気泳動
 【実験目的】
-:(1)　LB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする
+:(1)　12日にLB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする
-:(2)　pSB1A2及びpSB6A1のプラスミド抽出
+:(2)　前日に培養したpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のプラスミド抽出
-:(3)　DH5αにプラスミドpSB1A2及びpSB6A1が挿入されているかのチェック
+:(3)　DH5αに目的プラスミドpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)が挿入されているか制限酵素処理をすることによって確かめる
 【実験内容】
-:(1)　pSB3K3のトランスフォーメーション
+:(1)　pSB3K3(J04450)のトランスフォーメーション
 ::　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した
 ::　↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した
 ::　↓on　ice　30min
-::　↓45℃で45sec、ヒートショックを行った
+::　↓45℃で45sec、過熱した
 ::　↓on　ice　2min
 ::　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
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 ::　↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight
-:(2)　pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
+:(2)　pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のミニプレップ
-::　培養後のpSB1A2とpSB6A1を1.5mLチューブに取った
+::　培養後のpSB1A2(J44000)とpSB6A1(J04450)を1.5mLチューブに取った
 ::　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
 ::　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
@@ Line 46: / Line 41: @@
 ::　↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした
-:(3)　pSB1A2,pSB6A1の電気泳動
+:(3)　pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)の制限酵素処理と電気泳動
-:<TABLE BORDER="0"><TR>
+::<TABLE BORDER="0"><TR>
-:<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
+::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
-:<TD></TD><TD>組成1(pSB1A2)</TD><TD>組成2(pSB6A1)</TD></TR>
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-:<TD>''XbaⅠ'',''PstⅠ''</TD><TD>1μL</TD><TD>1μL</TD></TR>
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-:<TD>(2)で得たpSB1A2</TD><TD>5μL</TD><TD>-</TD></TR>
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+::<TD>(2)で得たpSB6A1<BR>プラスミド</TD><TD>-</TD><TD>5μL</TD></TR>
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-:37℃で1時間インキュベートした<BR>
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-:↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した<BR>
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-:　(マーカーは1kbp radderを使用した)<BR>
+::右の組成で1.5mlチューブ内で混合した
-:↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した<BR>
+::37℃で1時間インキュベートした
-:↓泳動結果を写真で撮影した<BR></TD></TR></TABLE>
+::↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した
-:</TD></TR></TABLE>
+::　(マーカーは1kbp radderを使用した)
+::↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した
+::↓泳動結果を写真で撮影した<BR></TD></TR></TABLE>
+::</TD></TR></TABLE>
 【実験結果】
-:(1)　コロニーが２つだけ確認できた(ピンク)
+:(1)　　2つのコロニーの生育を確認した(ピンク)
+:(2,3)　pSB6A1(J04450)→2本のバンドが確認できたことにより、目的プラスミドの挿入が確認できた
+::　pSB1A2(J44000)→バンドが検出できなかった
-:(3)　pSB6A1→Bandが確認、挿入が確かめられた
+【実験考察】
-::翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る
+:(1)
-::pSB1A2→Bandが現れなかった
+:(2,3)　翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る
-::翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う
+::　翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う