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Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August18
From 2010.igem.org
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→ゲル抽出<br> | →ゲル抽出<br> | ||
→10 uLを電気泳動で確認（TSUDA Marker 1） | →10 uLを電気泳動で確認（TSUDA Marker 1） | ||
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===だめぽでした！=== | ===だめぽでした！=== | ||
* おそらくゲル抽出後の吸着でうまくいかず，流れてしまった（小さすぎた） | * おそらくゲル抽出後の吸着でうまくいかず，流れてしまった（小さすぎた） | ||
Revision as of 05:04, 19 September 2010
since 13 Jul 2010
since 1 Aug 2010
RBS digestionのリベンジ
| 1-2M | 10 uL |
| DW | 4 uL |
| 10x M Buffer | 2 uL |
| BSA | 2 uL |
| Xba I | 1 uL |
| Pst I | 1 uL |
| Total | 20 uL |
→37℃で60分インキュベーション
- 4 uL 6x Sample Bufferを加え，12 uLずつ電気泳動した
→ゲル抽出
→10 uLを電気泳動で確認（TSUDA Marker 1）
だめぽでした！
- おそらくゲル抽出後の吸着でうまくいかず，流れてしまった（小さすぎた）
Ligation
Ligationに必要なDNA Solutionの調製
| パーツ | λ/Hind IIIと比べて (ng/10 uL) | ng/uL | 割合 | size (bp) | 必要 (ng) | 使用 (uL) |
| Vector | 50 ng/10 uL | 5 ng/uL | 1 | 2000 bp | 10 ng | 2 uL |
| RFP | 250 ng/uL | 25 ng/10 uL | 2 | 700 bp | 7 ng | 0.3 uL |
| double terminator | 5 ng/uL | 0.5 ng/uL | 2 | 200 bp | 2 ng | 4 uL |
| Total | 6.3 uL | |||||
Ligation & Transformation
| DNA solution | 6.3 uL |
| Ligation solution | 6.3 uL |
| T4 ligase | 1 uL |
- 16℃，30 min
- competent cell 50 uLに全量加えた（Transformation）
- 0℃，30 min
- 42℃，60 sec
- 5 min on ice
- add LB 100 uL
- 37℃，120 min
- spread onto the LBC
- 37℃，15~20 hrs
RBS 再リベンジ
Digestion後，エタ沈で回収を試みた
Digestion (Xba I, Pst I)
| （RBS）1-2M | 10 uL |
| DW | 4 uL |
| 10x M Buffer | 2 uL |
| BSA | 2 uL |
| Xba I | 1 uL |
| Pst I | 1 uL |
| Total | 20 uL |
→37℃，60 min
エタ沈
- 2 uLの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
- 44 uLのエタノールを加えた
- 液体窒素の中で凍らせた（1.5 mLのチューブに移す）
- 溶かしてから15,000 rpm @4℃で５分間遠心した
- 上清をほかのチューブに移した（一応これも遠心し，上清を捨て，同じ操作をした）
- 100 uLの70%エタノールで壁をリンスし，15,000 rpm @4℃で５分間遠心した
- 上清を捨て，真空デシケータで乾燥させた
- TE 5 uLで溶かした
電気泳動
- TEで溶かしたDNA Solution 1 uLに6x SB 1 uLを加えた
- 最初にとった上清も同じ操作をした
| レーン | |
| 2 | TSUDA Marker 1 |
| 3 | 上清 |
| 4 | DNA solution |
- DNA solutionにしっかり回収されていた
