"
Template:KIT-Kyoto-Augsut13
From 2010.igem.org
(Difference between revisions)
Matsubara3 (Talk | contribs) (→August 13) |
Matsubara3 (Talk | contribs) (→August 13) |
||
| Line 28: | Line 28: | ||
:(2) pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ | :(2) pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ | ||
| - | + | :: 培養後のpSB1A2とpSB6A1を1.5mLチューブに取った | |
| - | + | :: ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した | |
| - | + | :: ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた | |
| - | + | :: ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex) | |
| + | :: ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可) | ||
| + | :: ↓5min on ice | ||
| + | :: ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex) | ||
| + | :: ↓5min on ice | ||
| + | :: ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した | ||
| + | :: ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した | ||
| + | :: ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた | ||
| + | :: ↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した | ||
| + | :: ↓70％EtOHを1mL加えた(vortex) | ||
| + | :: ↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した | ||
| + | :: ↓上澄みを捨てた | ||
| + | :: ↓30秒間遠心乾燥を行った | ||
| + | :: ↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした | ||
| - | + | :(3) pSB1A2,pSB6A1の電気泳動 | |
| + | :<TABLE BORDER="0"><TR> | ||
| + | :<TD><TABLE BORDER="1"><TR> | ||
| + | :<TD></TD><TD>組成1(pSB1A2)</TD><TD>組成2(pSB6A1)</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>XbaⅠ,PstⅠ</TD><TD>1μL</TD><TD>1μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>(2)で得たpSB1A2プラスミド</TD><TD>5μL</TD><TD>-</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>(2)で得たpSB6A1プラスミド</TD><TD>-</TD><TD>5μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>H2O</TD><TD>11μL</TD><TD>11μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>H Buffer</TD><TD>1μL</TD><TD>2μL</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>M Buffer</TD><TD>1μL</TD><TD>-</TD></TR> | ||
| + | :<TR> | ||
| + | :<TD>計</TD><TD>20μL</TD><TD>20μL</TD></TR> | ||
| + | :</TABLE></TD> | ||
| + | :<TD></TD><TD></TD> | ||
| + | :<TD><TABLE BORDER="0"><TR> | ||
| + | :<TD> | ||
| + | :37℃で1時間インキュベートした<BR> | ||
| + | :↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した<BR> | ||
| + | : (マーカーは1kbp radderを使用した)<BR> | ||
| + | :↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した<BR> | ||
| + | :↓泳動結果を写真で撮影した<BR></TD></TR></TABLE> | ||
| + | :</TD></TR></TABLE> | ||
| - | + | 【実験結果】 | |
| + | :(1) コロニーが２つだけ確認できた(ピンク) | ||
| - | + | :(3) pSB6A1→Bandが確認、挿入が確かめられた | |
| - | + | ::翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る | |
| - | + | ::pSB1A2→Bandが現れなかった | |
| - | + | ::翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う | |
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | (3) | + | |
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
| - | + | ||
Revision as of 06:02, 15 September 2010
August 13
【時間】
- 9:00～21:00
【実験担当】
- 岩城,竹内,中村,吉村,足立
【実験名】
- (1) pSB3K3のトランスフォーメーション
- (2) pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
- (3) pSB1A2,pSB6A1の電気泳動
【実験目的】
- (1) LB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする
- (2) pSB1A2及びpSB6A1のプラスミド抽出
- (3) DH5αにプラスミドpSB1A2及びpSB6A1が挿入されているかのチェック
【実験内容】
- (1) pSB3K3のトランスフォーメーション
- -80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した
- ↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した
- ↓on ice 30min
- ↓45℃で45sec、ヒートショックを行った
- ↓on ice 2min
- ↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
- ↓37℃で1h、振とう培養した
- ↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight
- (2) pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
- 培養後のpSB1A2とpSB6A1を1.5mLチューブに取った
- ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
- ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
- ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
- ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)
- ↓5min on ice
- ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)
- ↓5min on ice
- ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
- ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
- ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
- ↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した
- ↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)
- ↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した
- ↓上澄みを捨てた
- ↓30秒間遠心乾燥を行った
- ↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした
- (3) pSB1A2,pSB6A1の電気泳動
組成1(pSB1A2) 組成2(pSB6A1) XbaⅠ,PstⅠ 1μL 1μL (2)で得たpSB1A2プラスミド 5μL - (2)で得たpSB6A1プラスミド - 5μL H2O 11μL 11μL H Buffer 1μL 2μL M Buffer 1μL - 計 20μL 20μL - 37℃で1時間インキュベートした
- ↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した
- (マーカーは1kbp radderを使用した)
- ↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した
- ↓泳動結果を写真で撮影した
【実験結果】
- (1) コロニーが２つだけ確認できた(ピンク)
- (3) pSB6A1→Bandが確認、挿入が確かめられた
- 翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る
- pSB1A2→Bandが現れなかった
- 翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う
